Формирование и рост фолликулов от примордиальной стадии до овуляции доминантного фолликула остается наиболее важной и еще недостаточно изученной частью репродукции человека. Формирование пула растущих фолликулов продолжается более 120 сут. При этом, по разным данным [1, 2], гормонально-независимый этап роста фолликулов длится от 180 до 300 сут, а гормонально-зависимый — до 65 дней (около двух овариально-менструальных циклов). Таким образом, возможность оказать экзогенное контролируемое влияние на рост и созревание фолликулов появляется на заключительных этапах продолжительного периода развития фолликулов.

Известно, что режим стимуляции (доза, состав препаратов гонадотропинов) оказывает непосредственное влияние на количественный и качественный состав получаемых ооцитов и соответственно эмбрионов. Более того, доказано влияние режима стимуляции суперовуляции на частоту возникновения анеуплоидий у эмбрионов [3]. В связи с чем для снижения риска анеуплоидий эмбрионов рекомендуется использование более мягких протоколов овариальной стимуляции [3].

В исследовании V. Sagot и соавт. [4] установлено, что сами по себе процедуры оплодотворения in vitro (пункция фолликулов, подготовка спермы, оплодотворение ооцитов методом инсеминации или ИКСИ, культивирование эмбрионов), возможно, не способствуют повышению врожденных пороков развития.

Цель настоящего исследования — оценка морфологического состояния эмбрионов на 2-й и 3-й дни культивирования в зависимости от выбранных препаратов гонадотропинов, используемых для стимуляции суперовуляции у пациенток.

101 наблюдавшаяся женщина имела регулярный овариально-менструальный цикл. Содержание ЛГ, ФСГ, антимюллерова гормона, пролактина, прогестерона, эстрадиола, тестостерона соответствовало референсным значениям. В исследование включались все пациентки, у которых на момент пункции фолликулов было получено более одного зрелого ооцита (МII) и на 2-й и 3-й дни культивирования имелось более одного высококачественного эмбриона. Из исследования были исключены пары, где был использован донорский биоматериал (ооциты и/или сперматозоиды), а также пациентки, у которых не было получено эмбрионов высокого качества.

Все пациентки были разделены случайным образом на две группы. В 1-ю группу вошли 52 женщины, средний возраст которых составил 31,95±5,45 года. Данным пациенткам для контролируемой стимуляции овуляции был назначен препарат рекомбинатного ФСГ (Puregon, «N.V. Organon», Нидерланды). Во 2-ю группу вошли 49 пациенток, средний возраст которых составил 34,00±5,74 года. Стимуляцию суперовуляции им проводили с помощью высокоочищенного человеческого ФСГ (Alterpure, «IBSA Institut Biochimique, S.A.», Швейцария).

Трансвагинальную пункцию фолликулов проводили под контролем ультразвукового сканера через 35—36 ч после инъекции 10 000 МЕ мочевого чХГ (Pregnyl, «Organon», Нидерланды). Пациенткам во время аспирации фолликулов проводилось обезболивание.

Полученные комплексы кумулюс—корона—ооцит (ККО) отмывались и культивировались до оплодотворения в среде культивирования эмбрионов (Cleavage Medium, «Sage», США) при 37 °С, в атмосфере 6% СО₂. Эякулят обрабатывали методом ступенчатого градиента (PureCeption, «Sage», США). Оплодотворение проводили методом ИКСИ, используя стандартную методику. Оценку нормального оплодотворения проводили под инвертированным микроскопом (×400) через 16—18 ч после оплодотворения (1-й день). О наличии нормального оплодотворения судили по наличию зиготы с двумя пронуклеусами. Зиготы помещали в индивидуальные капли (объемом 30 мкл) среды для культивирования эмбрионов (Cleavage Medium, «Sage», США), покрытые минеральным маслом. Утром 3-го дня эмбрионы переносили в индивидуальные капли среды для культивирования бластоцист (Blastocyst Medium, «Sage», США), покрытые минеральным маслом.

Анализ морфологических параметров эмбрионов проводили ежедневно под инвертированным микроскопом (×400), через стандартный временной интервал. Параметры оценки морфологии эмбрионов включали: количество бластомеров, равномерность бластомеров, синхронность дробления, степень фрагментации (0, <10, 10—25, >25%), локализацию фрагментации (локальная, рассеянная), наличие вакуолей, визуализацию многоядерности. Общая оценка эмбрионов была основана на определении отдельных параметров качества.

Эмбрионы относились к высококачественным, если на утро 2-го дня культивирования они состояли из 4—5 бластомеров, с равномерными/неравномерными бластомерами, без вакуолей, со степенью фрагментации ≤10%, а на 3-и сутки культивирования — из 6—8 бластомеров, с равномерными/неравномерными бластомерами, без вакуолей, со степенью фрагментации ≤10%.

Процентное содержание зрелых ооцитов (МII) рассчитывалось от общего числа полученных ооцитов.

Частота оплодотворения рассчитывалась как процентное отношение числа нормально оплодотворенных зигот к общему числу полученных ооцитов.

Процентное содержание высококачественных эмбрионов (ТОР-эмбрионов) на 2-й и 3-й дни культивирования рассчитывалось от общего числа полученных эмбрионов.

Параметрическими методами выполнялась описательная статистика с целью расчета средних значений (М) и средних квадратичных отклонений (s). Учитывая небольшой количественный состав исследуемых групп пациенток, сравнение их результатов проводилось непараметрическими методами с использованием критерия Манна—Уитни. При этом во внимание принимались результаты, где уровень статистической значимости (р) обнаруженных различий был ≤0,05 (95%).

Все полученные данные обрабатывались с применением пакета прикладных статистических программ Statistica 10.

Результаты проведенного исследования представлены в таблице.

Как видно из таблицы, во 2-й группе имеет место статистически значимое снижение количества фолликулов на момент их аспирации по сравнению с 1-й группой (11,76 против 16,05). Также обращает на себя внимание статистически значимое увеличение процентного содержания эмбрионов высокого качества на 2-й и 3-й дни культивирования в группе пациенток, у которых контролируемая стимуляция суперовуляции проводилась с применением препарата высокоочищенного человеческого ФСГ по сравнению со значениями соответствующих показателей в 1-й группе. Так, содержание ТОР-эмбрионов во 2-й группе на 2-й день культивирования выше на 30,91% (77,17 и 46,26 соответственно) и на 10,44% на 3-й день культивирования (63,09 и 52,65 соответственно) по сравнению со значениями в 1-й группе.

Анализ полученных данных в исследуемых группах пациенток не выявил статистически значимых изменений в значениях таких показателей, как количество полученных ККО, процентное содержание зрелых ооцитов (МII) и частота оплодотворения.

Выбор в качестве объекта исследования преимплантационных эмбрионов на 2-й и 3-й дни культивирования не случаен. Как известно, активация экспрессии генома эмбрионов начинается лишь со стадии 4—8 бластомеров [5]. В связи с чем можно сделать предположение, что на выбранных для анализа сроках преимплантационного онтогенеза имеет место реализация потенциала самого ооцита.

Анализ полученных результатов позволяет заключить, что природа препаратов гонадотропина не оказывает влияния на процентное содержание зрелых ооцитов и частоту оплодотворения. При этом, как видно из таблицы, при применении высокоочищенного человеческого ФСГ имеет место статистически значимое снижение количества рекрутируемых фолликулов (11,76 против 16,05) и тенденция к снижению числа получаемых ооцитов. Эти результаты согласуются с ранее проведенным исследованием [6], показавшим, что применение высокоочищенного человеческого ФСГ приводит к формированию меньшего числа фолликулов и ооцитов по сравнению с применением рекомбинантного ФСГ.

Согласно данным литературы [7], увеличение числа полученных ооцитов от 1 до 5 и приводит к значительному повышению частоты наступления беременности, а при получении более 6 ооцитов значения данного показателя, хотя и продолжают увеличиваться, но более умеренно. В связи с чем, рост числа рекрутируемых фолликулов и получаемых ооцитов не приводит к повышению частоты наступления клинической беременности, а может лишь спровоцировать развитие тяжелых форм гиперстимуляции.

Как видно из приведенных данных, применение высокоочищенного человеческого ФСГ обусловило статистически значимое доминирование процентного содержания эмбрионов высокого качества по сравнению с аналогичными данными в группе пациенток, получивших для стимуляции суперовуляции препарат рекомбинантного ФСГ. При этом наибольшая разница отмечается на 2-й день культивирования. Уменьшение разницы в содержании ТОР-эмбрионов на 3-й день культивирования между группами, по нашему мнению, обусловлено началом активации генома самих эмбрионов и возможным включением компенсаторных и/или репаративных процессов. Полученные нами результаты нашли свое подтверждение в работе G. Koulianos [6], где указывается, что применение высокоочищенного человеческого ФСГ приводит к снижению числа получаемых ооцитов при увеличении количества эмбрионов высокого качества по сравнению с рекомбинантным ФСГ.

Исследование, выполненное A. Coomarasamy и соавт. [9], показало увеличение на 4% частоты рождения живых плодов при использовании высокоочищенного человеческого ФСГ в сравнении с рекомбинантным ФСГ в длинном протоколе в циклах ЭКО/ИКСИ.

В заключение можно сделать предположение, что использование препаратов высокоочищенного человеческого ФСГ в сравнении со схемами стимуляции суперовуляции, где были применены препараты рекомбинантного ФСГ, позволяет создавать более благоприятные условия для финальных процессов созревания фолликулов в организме женщины, приближая их тем самым к параметрам естественного овариально-менструального цикла, и получать большее число эмбрионов высокого качества.