Хромосома Y человека, помимо гена SRY, ответственного за развитие организма по мужскому типу, содержит ряд генов, необходимых для нормального формирования сперматозоидов. Около 35 лет назад на длинном плече Y-хромосомы был обнаружен локус, названный «фактором азооспермии» (azoospermia factor — AZF). Микроделеции этого локуса приводят к различным формам мужского бесплодия, таким как азооспермия или олигозооспермия, и выявляются в среднем у 7,3% инфертильных мужчин, достигая 50% в некоторых анализируемых группах [1—3]. Внутри AZF-локуса были выделены три неперекрывающиеся функциональные последовательности — AZFa, AZFb и AZFc, каждая из которых может полностью или частично делетироваться при гомологичной рекомбинации между палиндромными повторами [4]. На текущий момент описано несколько десятков генов, содержащихся в этих последовательностях [5].

Идентификация микроделеций AZF-локуса важна для клинической диагностики мужского бесплодия, поэтому разработка метода, позволяющего быстро и достоверно детектировать данные микроделеции у пациента, является актуальной задачей.

Цель настоящего исследования — разработка диагностической системы для выявления микроделеций локусов AZFa, AZFb и AZFc с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени.

ДНК выделяли из венозной крови с использованием стандартной процедуры, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз белков протеиназой К, очистку ДНК экстракцией примесей фенол-хлороформом и осаждение ДНК этанолом.

Выявление микроделеций локусов AZFa, AZFb и AZFc проводили с помощью двух тетраплексных ПЦР в режиме реального времени с использованием TaqMan-зондов. ПЦР проводилась в конечном объеме 25 мкл, содержащем 65 мМ трис-HCl (рН 8,9), 16 мМ (NH₄)₂SO₄, 3,0 мМ MgCl₂, 0,05% твин 20, 0,2 мМ растворы дезоксинуклеозидтрифосфатов, 0,4 мкМ растворы олигонуклеотидных праймеров, 0,1 мкМ растворы TaqMan-зондов (см. таблицу),

Проверку наработки специфических фрагментов ДНК проводили методом электрофоретического разделения продуктов реакционной смеси в 8% полиакриламидном геле. Для визуализации результатов электрофореза гель окрашивали 0,01% раствором бромида этидия. Электрофореграмму документировали при помощи трансиллюминатора и CCD-камеры Gel Doc («Bio-Rad», США).

В настоящей работе была разработана тест-система, позволяющая выявлять микроделеции регионов AZFa, AZFb и AZFс, расположенных на длинном плече Y-хромосомы. Для детекции вышеуказанных делеций был выбран метод ПЦР в режиме реального времени с использованием TaqMan-зондов [6]. Данный метод является простым в исполнении и позволяет получать надежный результат за сравнительно небольшое время (суммарное время анализа составляет около 2 ч, не включая времени, требующегося для выделения ДНК).

При разработке диагностической системы руководствовались рекомендациями, приведенными в работе [2]. Для получения достоверного и воспроизводимого результата авторы данной статьи рекомендуют анализировать как минимум два неполиморфных локуса внутри каждого из регионов: sY84 и sY86 в регионе AZFa, sY127 и sY134 в регионе AZFb и sY254 и sY255 в регионе AZFc. Для внутреннего контроля прохождения ПЦР авторы предлагают амплифицировать консервативный локус sY14, расположенный в гене SRY на коротком плече Y-хромосомы.

В соответствии с рекомендациями M. Simoni и соавт. [2] нами были подобраны пары праймеров для амплификации каждого из семи вышеуказанных локусов с помощью двух тетраплексных ПЦР. В ходе тетраплексной ПЦР-1 амплифицировали локусы sY84, sY127, sY255 и локус sY14 (внутренний контроль), в ходе тетраплексной ПЦР-2 — sY86, sY134, sY254 и локус sY14 (внутренний контроль). Для всех нарабатываемых участков ДНК были подобраны TaqMan-зонды, позволяющие наблюдать кинетику накопления продуктов амплификации в режиме реального времени. Для каждой тетраплексной ПЦР использовали четыре зонда, комплементарные амплифицируемому участку и несущие на 5’-конце разные флуорофоры (FAM, R6G, ROX и CY5). Структуры олигонуклеотидных праймеров и TaqMan-зондов приведены в таблице.

Продукты обеих тетраплексных ПЦР имели длины (см. таблицу), позволяющие разделить их методом электрофореза в 8% полиакриламидном геле. Это позволило проверить наработку специфических продуктов амплификации для дополнительного контроля качества разработанной тест-системы.

При оптимизации условий ПЦР варьировали температуру отжига праймеров, концентрации праймеров и состав амплификационного буфера. Особое внимание уделялось воспроизводимости результатов, отсутствию неспецифических фрагментов амплификации и близких по значению эффективностей реакций, составляющих тетраплексные ПЦР. В качестве положительного контроля использовалась ДНК фертильного мужчины (контроль специфичности и чувствительности реакции), а в качестве отрицательного контроля — ДНК фертильной женщины и вода (контроль специфичности и отсутствия контаминации). Условия проведения ПЦР описаны в разделе «Материал и методы».

Иллюстрация работы метода

На рис. 1

Для образца ДНК фертильного мужчины происходит наработка фрагментов sY84, sY127, sY255, sY14 в ходе ПЦР-1 и фрагментов sY86, sY134, sY254, sY14 в ходе ПЦР-2 (накопление флуоресценции во всех каналах — CY5, FAM, R6G, ROX). Для образца ДНК мужчины, имеющего делецию локуса AZFc, нарабатываются фрагменты sY84, sY127 и sY14 в ходе ПЦР-1 и фрагменты sY86, sY134 и sY14 в ходе ПЦР-2 (накопление флуоресценции в каналах CY5, R6G и ROX). Наработки фрагментов sY255 и sY254 не происходит, соответственно отсутствует накопление флуоресценции в канале FAM.

На рис. 2

Разработана тест-система для выявления микроделеций локусов AZFa, AZFb и AZFс Y-хромосомы человека с помощью двух тетраплексных ПЦР в режиме реального времени, позволяющая получать надежные и воспроизводимые результаты.

Благодарности. Работа была выполнена при финансовой поддержке Интеграционных грантов СО РАН №84 и №17, а также Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 гг., ГК №16.740.11.0633 от 02.06.11.