Анализ фрагментации ДНК в сперматозоидах с помощью окраски акридиновым оранжевым у пациентов с бесплодием

Мужской фактор вносит существенный вклад в структуру репродуктивных нарушений у человека. В настоящее время помимо стандартных исследований качества эякулята большое внимание уделяется анализу ДНК сперматозоидов [1]. Фрагментация ДНК, представляющая собой одно- и двухцепочечные разрывы молекулы ДНК, является новым показателем оценки качества эякулята.

Обзор факторов, ответственных за фрагментацию ДНК в сперматозоидах человека, до настоящего времени не позволяет выявить главный механизм [2, 3]. Во фрагментацию ДНК вовлечены, как считается, такие процессы, как апоптоз в ходе сперматогенеза, нарушения ремоделинга хроматина, посттестикулярное воздействие активных форм кислорода, активация внутриклеточных каспаз и эндонуклеаз в зрелых сперматозоидах, воздействие токсичных веществ, ионизирующих излучений, иных факторов среды [2].

Несмотря на неопределенность в понимании как самих механизмов фрагментации, так и возможностей репарирующего воздействия со стороны ооцита и эмбриона, многими авторами выявлено негативное влияние высокого уровня фрагментации ДНК на развитие эмбрионов [4, 5]. В отношении частоты спонтанного прерывания беременности получены существенные доказательства эффекта фрагментации ДНК. Метаанализ, проведенный L. Robinson и соавт. [6], доказывает достоверное увеличение частоты абортов при высоком уровне фрагментации ДНК.

В отношении взаимосвязи фрагментации ДНК и стандартных параметров эякулята, частоты оплодотворения и имплантации данные разных авторов разноречивы [7, 8]. Недавние исследования F. Bronet и соавт. [9] показывают отсутствие корреляции между уровнем анеуплоидии и уровнем фрагментации ДНК в сперматозоидах.

На сегодняшний день применяется несколько методов оценки фрагментации ДНК: TUNEL assay [terminal deoxynucleotidil transferasis (TdT) dUTP and labeling], COMET assay (электрофорез единичных клеток), метод окраски толуидиновым синим, метод Halosperm (позволяет видеть в световом микроскопе фрагментированную ДНК по образующемуся ореолу вокруг клетки) и др. [10]. Широкое применение в мире получил метод оценки фрагментации ДНК в сперматозоидах, предложенный D. Evenson и соавт. [11], — SCSA (sperm chromatin structure assay). Он основан на разной чувствительности ДНК с разрывами и интактной ДНК к кислотной денатурации. Окрашивание с помощью метахроматического флуорохрома акридинового оранжевого позволяет различить интактную двухцепочечную ДНК, в которой интеркалирующий акридиновый оранжевый флюоресцирует зеленым, и одноцепочечную, флюоресцирующую красным. Применение проточной цитометрии позволяет автоматизировать метод, повысить объективность оценки и анализировать достаточно большое число клеток.

Достаточно много работ посвящено изучению возможности использования антиоксидантной терапии для снижения уровня фрагментации ДНК в сперматозоидах [12, 13]. Так, E. Greco и соавт. [12] выявили, что пероральный прием антиоксидантов (витамин Е и витамин С по 1 г в сутки) в течение 2 мес достоверно снижает процент сперматозоидов с фрагментированной ДНК. В ряде других исследований [13] был также показан положительный эффект от применения таких антиоксидантов, как L-карнитин, цинк, селен, глутатион.

Цель настоящей работы — анализ взаимосвязи индекса фрагментации ДНК сперматозоидов (ИФД), подсчитанного при использовании окраски сперматозоидов акридиновым оранжевым, показателей стандартных исследований эякулята и эффективности антиоксидантной терапии, направленной на уменьшение процента сперматозоидов с фрагментированной ДНК.

Исследование проводилось на образцаx эякулята 446 пациентов (средний возраст 33,5±5,8 года), обследовавшихся в Красноярском центре репродуктивной медицины (КЦРМ) в период с сентября 2010 г. по март 2011 г. Из них 34 пациента проходили антиоксидантную терапию с последующим повторным анализом ИФД.

Проводился стандартный анализ эякулята, включающий подсчет общей концентрации сперматозоидов, концентрации прогрессивно подвижных и аномальных сперматозоидов, анализ строгой морфологии по Крюгеру [14], а также анализ на иммунологическое бесплодие методом МАР (mixed antiglobulin reaction) (Ferti Pro N.V. Бельгия).

Уровень фрагментации ДНК в сперматозоидах исследовали методом SCSA с нашими модификациями [15]. Образец спермы разводили в TNE-буфере (0,01 М Трис, 1 мМ ЭДТА, 0,15 М NaCl, pH 7,4) до концентрации сперматозоидов 1 млн/мл. К 100 мкл разведенных в буфере сперматозоидов добавляли 200 мкл кислотного буфера (0,1% Тритон-X-100, 0,15 М NaCl, 0,08 н. HCl, pH 1,2). После 30 с инкубации добавляли 600 мкл красящего раствора, содержащего 6 мг/л акридинового оранжевого в растворе: 0,2 М Na2HPO4, 1 мМ ЭДТА (дисодиум), 0,15 M NaCl, 0,1 M лимонной кислоты (pH 6,0).

Анализ количества сперматозоидов с красной и зеленой флюоресценцией осуществлялся на флюоресцентном цитометре Guava Easy Cyte Mini («Guava», США). Подсчитывали 5000 клеток в каждом образце. Каждый образец оценивался в трех повторностях. ИФД рассчитывался по формуле:

где N1 — число сперматозоидов с красной флюоресценцией, N2 — число сперматозоидов с зеленой флюоресценцией. За норму принимались показатели ИФД ≤15%, к пограничным значениям относили ИФД >15%, но <27% и к высокому количеству сперматозоидов с фрагментированной ДНК относили образцы с ИФД >27% [16].

Пациентам с ИФД >15% была рекомендована консультация андролога. Дополнительное обследование включало ультразвуковое исследование мошонки, анализ на гормоны, мазки на чистоту флоры, ПЦР-исследование и бактериологический посев на выявление инфекций. После постановки диагноза назначалось соответствующее лечение, включающее антиоксидантную терапию. Назначался мексидол по 125 мг, спермактин по 5 г и витамин Е по 400 мг 2 раза в день в течение 2 мес, вобэнзим 5 таблеток 3 раза в день в течение 10 дней, далее по 3 таблетки 3 раза в день в течение 20 дней и витамин С 1000 мг в течение 10 дней. Кроме того, в ходе терапии исключался прием алкоголя, никотина, прием жирной и острой пищи, ограничивалось употребление кофе, крепкого чая. Рекомендовались умеренные физические нагрузки, здоровое питание с преобладанием белковой пищи, овощей, фруктов. Повторное исследование эякулята на выявление уровня фрагментации сперматозоидов проводилось после лечения (в среднем через 2 мес).

При статистической обработке результатов использовали пакет Statistica 7.0. Рассчитывали медиану (Me), 25-й и 75-й квартили. Применяли корреляционный метод Спирмена; критерии Вилкоксона, Манна—Уитни, χ².

В ходе стандартного спермиологического анализа у 13 (2,9%) человек была выявлена олигозооспермия, у 46 (10,3%) — астенозооспермия, у 31 (6,9%) — тератозооспермия и у 226 (50,7%) — нормозооспермия. У 116 (26,0%) пациентов отмечались сочетанные варианты. Положительный МАР-тест наблюдался у 14 (3,1%) пациентов.

По результатам анализа фрагментации ДНК сперматозоидов у 147 (32,9%) пациентов показатели ИФД были меньше 15%, у 183 (41,0%) — больше 15%, но меньше 27% и у 114 (25,5%) — больше 27%.

В табл. 1

При анализе взаимосвязи ИФД со стандартными показателями эякулята выявлена обратная корреляция ИФД с общей концентрацией сперматозоидов (r=–0,43; p<0,05), процентом прогрессивно-подвижных сперматозоидов (r=–0,52; p<0,05) и процентом морфологически нормальных форм (r=–0,41; p<0,05). Прямая корреляция была установлена с индексом дефектности сперматозоидов — ИДС (r=0,52; p<0,05) и с индексом тератозооспермии — ИТЗ (r=0,54; p<0,05) (рис. 1).

В связи c обнаруженной корреляцией между уровнем фрагментации ДНК и показателями ИТЗ и ИДС нами была проанализирована взаимосвязь ИФД и частоты встречаемости отдельных морфологических аномалий в сперматозоидах. На рис. 2

В табл. 2

Результаты сравнительного анализа показателей ИФД в сперматозоидах у пациентов, получавших антиоксидантную терапию, до и после лечения представлены на рис. 3.

В 2 (5,9%) случаях не наблюдалось изменения параметров уровня фрагментации в сперматозоидах после лечения.

Несмотря на выявленный ответ уровня фрагментации на терапию, у 8 (23,5%) человек при повторном исследовании уровня фрагментации ДНК отмечалось увеличение ИФД по сравнению с первоначальным результатом. Анализ историй болезни показал, что 5 человек в данный период болели острой респираторной вирусной инфекцией с повышением температуры тела, у 3 было обострение хронического простатита.

В последнее время фрагментация ДНК сперматозоидов рассматривается как один из важных факторов репродуктивных нарушений у человека. Это ведет к расширению применения методов ее определения в клинической практике. Метод окраски сперматозоидов акридиновым оранжевым хорошо зарекомендовал себя по всему миру благодаря своей простоте в исполнении и достоверности получаемых данных при сравнении с другими анализами фрагментации ДНК [17]. В настоящее время в КЦРМ данный метод внедрен в практику обследования пациентов. В представленном исследовании проведен анализ корреляции ИФД со стандартными показателями качества эякулята, а также выявлено влияние антиоксидантной терапии при высоких уровнях ИФД.

В нашем исследовании установлено, что 25% обследованных пациентов имели высокий уровень фрагментации ДНК. За высокий уровень фрагментации принималось значение ИФД >27%. Необходимо отметить, что границы нормы у разных авторов варьируют, в том числе в зависимости от метода, используемого для анализа фрагментации ДНК: норма — от 10 до 15%, высокие показатели ИФД — от 27 до 30% [6].

Выявлено, что уровень ИФД в сперматозоидах коррелировал со стандартными показателями качества эякулята, а именно общей концентрацией сперматозоидов, количеством прогрессивно подвижных форм, количеством нормальных сперматозоидов. В отношении такой зависимости данные литературы разноречивы. В работе Э.А. Терещенкова и соавт. [18] не было выявлено корреляции между уровнем фрагментации ДНК в сперматозоидах и концентрацией прогрессивно подвижных сперматозоидов, но наблюдалась обратная корреляция с процентом нормальных форм по Крюгеру. А. Zini и соавт. [19] не обнаружили взаимосвязи ИФД и антиспермальных антител, что согласуется с результатами нашего исследования. В работе M. Muratori и соавт. [20] не было выявлено зависимости уровня фрагментации сперматозоидов от общей концентрации сперматозоидов и процента прогрессивно подвижных форм.

Установленная нами взаимосвязь ИФД и стандартных спермиологических параметров свидетельствует в пользу того, что процесс фрагментации ДНК в большинстве случаев тесно связан с нарушением сперматогенеза, на что указывает обратная корреляция количества сперматозоидов с фрагментированной ДНК, с количеством морфологически нормальных форм и прямая корреляция с ИТЗ. Нами было показано, что частота высокого уровня ИФД выше при всех вариантах патоспермии в сравнении с нормозооспермией.

Несмотря на выявленную нами связь уровня фрагментации ДНК с показателями спермограммы, наблюдались случаи высокого значения ИФД (>27%) при нормозооспермии. Ввиду многообразия механизмов фрагментации ДНК можно предполагать, что процессы, приводящие к фрагментации, могут в ряде случаев протекать независимо от нарушения других показателей сперматогенеза. Выявленные случаи высокого уровня ИФД могут свидетельствовать о возможных причинах бесплодия неустановленного генеза или прерывания беременности на ранних сроках. Это еще раз свидетельствует, что анализ фрагментации ДНК может служить дополнительным критерием при оценке качества эякулята.

К одним из факторов, приводящих к фрагментации ДНК, относят воздействие свободных радикалов кислорода. В то время как образование радикалов в низких концентрациях необходимо для нормального функционирования сперматозоидов, их высокие концентрации, которые образуются в дефектных сперматозоидах и лейкоцитах, вызывают нарушения в цепях ДНК [21]. В проведенном ранее в КЦРМ исследовании было выявлено, что продукты перекисного окисления липидов, а именно: диеновых конъюгатов и малонового диальдегида, тесно коррелировали со стандартными параметрами эякулята, что еще раз доказывает неблагоприятное влияние активных форм кислорода на качество спермы [22].

Полученные нами данные о достоверном снижении ИФД после прохождения пациентами курса антиоксидантной терапии, сочетанной с коррекцией образа жизни, показали, что во многих случаях возможной причиной фрагментации ДНК сперматозоидов может служить окислительный стресс различной этиологии. Тем не менее в ряде случаев наблюдалось повышение ИФД у пациентов с обострением в данный период хронического простатита. Можно полагать, что увеличение уровня фрагментации ДНК обусловлено повышением продукции активных форм кислорода при воспалительном простатите, как показано в работе В.А. Божедомова и соавт. [23].

Несмотря на большое количество данных о положительном действии антиоксидантной терапии, которая не только уменьшает уровень фрагментации ДНК в сперматозоидах, но и улучшает общие показатели спермограммы, а также повышает частоту оплодотворений в циклах ВРТ, существуют некоторые противоречия в применении данной терапии. В основном данные противоречия основаны на недостаточном количестве рандомизированных клинических исследований. Кроме того, не вполне понятны эффективные дозы назначаемых антиоксидантов, а также индивидуальные реакции на данные препараты [24]. Тем не менее назначение противовоспалительной и антиоксидантной терапии может стать одной из стратегий при лечении мужского бесплодия.

Фрагментация ДНК в сперматозоидах играет важную роль в нарушении функционирования генома мужских гамет. Отмеченная нами корреляция уровня ИФД со стандартными параметрами эякулята, а также показателями строгой морфологии по Крюгеру свидетельствует о целесообразности использования данного метода при обследовании мужчин с репродуктивными нарушениями. Выявлено, что при корректировке высокого уровня фрагментации ДНК в сперматозоидах антиоксидантной терапией в большинстве случаев данная стратегия дает положительный эффект. Остаются недостаточно ясными механизмы, влияющие на фрагментацию ДНК в сперматозоидах, закономерности влияния высокого уровня ИФД на оплодотворяющую способность сперматозоидов, развитие и имплантационную способность эмбриона, а также на прерывание беременности на ранних сроках. В связи с этим планируется проведение дополнительных исследований взаимосвязи показателей ИФД и частоты наступления беременности в программах ЭКО и ЭКО-ИКСИ на базе КЦРМ.