Болезнь Иценко-Кушинга (БИК) - тяжелое нейроэндокринное заболевание, обусловленное хронической гиперпродукцией АКТГ опухолью гипофиза [1] и повышенной выработкой кортизола корой надпочечников, что обусловливает симптомокомплекс эндогенного гиперкортицизма, угрожающий жизни пациента [2]. БИК - наиболее частая причина эндогенного гиперкортицизма, однако в 10-15% случаев наблюдается эктопическая секреция АКТГ опухолью любой локализации [3]. Все пациенты с подозрением на АКТГ-зависимый гиперкортицизм направляются на магнитно-резонансную томографию (МРТ) гипофиза. Однако традиционные методы МРТ обладают низкой чувствительностью (аденома выявляется только у 50% пациентов). Чувствительность метода повышается до 80% при использовании контрастного усиления [4, 5]. Вместе с тем выявление микроаденомы, особенно менее 5-6 мм в диаметре, не обязательно означает установление причины заболевания. Согласно популяционным исследованиям [6], инциденталомы гипофиза выявляются у 10-20% здоровых людей.

До 20% пациентов с АКТГ-зависимым эндогенным гиперкортицизмом направляются на процедуру забора крови из нижних каменистых синусов [7]. Вместе с тем при нейрохирургическом вмешательстве у пациентов с ранее не обнаруженной при МРТ аденомой находят опухоли, по объему сопоставимые с микроаденомами, выявляемыми с помощью МРТ [8]. Причина этого феномена не ясна. Можно предположить, что увеличение разрешающей способности МРТ (путем повышения индукции магнитного поля до 3 или 6 Тесла) позволит выявлять ранее невидимые микроаденомы. Поскольку выявление аденомы зависит от ее способности накапливать контрастный препарат, строение сосудов в опухолях могло бы влиять на этот процесс и, следовательно, определять возможность визуализации опухоли при МРТ.

Цель исследования - оценить связь морфологии кровеносных и лимфатических сосудов в АКТГ-секретирующих опухолях гипофиза у пациентов с БИК с возможностью выявления опухолей при МРТ.

Ретроспективное когортное исследование. Для иммуногистохимического исследования были отобраны достаточные по объему образцы гистологически подтвержденных кортикотропином. Хирургическое вмешательство проводилось у пациентов с лабораторно подтвержденным АКТГ-зависимым эндогенным гиперкортицизмом. В случаях отсутствия видимой аденомы при МРТ с контрастным усилением проводили селективный забор крови из нижних каменистых синусов для исключения синдрома эктопированной продукции АКТГ и инценденталомы гипофиза размером менее 6 мм. МРТ-исследование проводилось на аппарате Siemens Magnetom Harmony 1.0T с контрастом на основе гадолиния.

В исследование не были включены и не подвергались анализу ткани:

• в которых аденома не была выявлена при повторном гистологическом исследовании;

• в случае малого количества ткани опухоли, предоставленной для морфологического исследования;

• аденомы гипофиза с обильными кровоизлияниями различной степени давности;

• полученные при повторных нейрохирургических вмешательствах.

Все клинические, лабораторные и инструментальные манипуляции, выполненные в рамках данного исследования, были проведены на базе одного учреждения (ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России, Москва).

В исследовании использовали биологический материал пациентов, прооперированных с 2009 по 2014 г., которые проходили процедуру селективного забора крови из нижних каменистых синусов и подписывали добровольное информированное согласие на использование биологического материала в научных целях.

Проведена оценка плотности (количества сосудов на единицу площади) и диаметра кровеносных сосудов в тканях опухоли, которые визуализировались и не визуализировались при МРТ с контрастным усилением.

Гистологические препараты оценивались двумя независимыми морфологами. Расхождение результатов было отмечено лишь в 3 случаях (аденома гипофиза и гиперплазия аденогипофиза), что потребовало привлечения третьего эксперта. Иммуногистохимическое исследование (ИГХ) отобранных аденом гипофиза проводилось с антителами к СD34 (клон QBEnd/10, RTU, «Leica»), D2−40 (клон D2−40, RTU, «Dako») и Ki-67 (клон MIB-1, RTU, «Dako»). Индекс пролиферации Ki-67 рассчитывался для оценки агрессивного потенциала роста новообразования и как следствие - повышения ангиогенеза в ткани опухоли. ИГХ-исследование было проведено на автоматизированной системе Bondmax («Leica») с использованием полимерной системы Bond Polymer Refine Detection system («Leica») в соответствии со стандартными протоколами для Ki-67, D2−40, CD34. Для оценки ангиогенеза с помощью ИГХ метода было выбрано антитело к CD34, поскольку интенсивность реакции с данным маркером в кортикотропиномах была выше, чем с антителами к CD31. При микроскопическом исследовании обработанных ИГХ методом тканей аденом с увеличением ×200 на каждом срезе было выбрано поле с максимальной плотностью сосудов. Фиксацию цифровых изображений выбранных полей проводили с помощью камеры Leica DFC 490. Для обработки цифровых изображений использовали программное обеспечение Leica Application Suite V3. С помощью компьютерной системы анализа изображения была определена площадь просвета сосудов (в мкм). Отдельно измеряли диаметры самого крупного и самого мелкого сосудов в выбранных полях каждого из срезов (в мкм). Затем подсчитывали средний диаметр сосудов, расположенных в 0,3 мм² выбранного поля каждого среза, с вычислением среднего значения.

Количество капилляров подсчитывали в поле зрения светового микроскопа Leica DMLS2 при увеличении ×200 с помощью лабораторного счетчика. Полуколичественным методом оценивали долю (в %) щелевидных сосудов (диаметр которых с помощью светового микроскопа при увеличении ×400 установить не удалось) в каждом выбранном поле. Индекс пролиферации Ki-67 был рассчитан как доля Ki-67-положительных ядер в 500 клетках; для оценки индекса пролиферации была выбрана область с наибольшим количеством иммуноположительных клеток («горячих точек») на каждом срезе.

Локальным Этическим комитетом ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России, согласно протоколу № 12 Заседания Комитета от 28.10.15, постановлено, что планируемая научная работа соответствует этическим стандартам добросовестной клинической практики и может быть проведена на базе отделения нейроэндокринологии и остеопатий ФГБУ «ЭНЦ».

Статистическая обработка полученных результатов выполнена с помощью программы SPSS 16.0. Описание количественных данных представлено в виде медианы (Me) и процентилей (Q25%;Q75%). Соотношения качественных признаков представлены в виде долей. Сравнительный анализ количественных признаков в подгруппах проводили с помощью критерия Манна-Уитни; значимыми считали различия при p<0,05.

На первом этапе в исследование было включено 25 образцов тканей опухоли пациентов (19 женщин и 6 мужчин) в возрасте 36 (28; 48) лет; самому младшему было 16 лет, а старшему - 53 года.

В 1-ю группу вошли образцы ткани от 7 пациентов, аденома гипофиза у которых не была визуализирована при МРТ с контрастированием.

Во 2-ю группу вошли ткани от 18 пациентов, аденома которых была визуализирована до операции. Общие характеристики пациентов сведены в табл. 1.

Содержание кортизола в суточной моче во второй группе составило 1755 нмоль/сут (885; 2289) (мин. 602,3 нмоль/сут, макс. 4800 нмоль/сут, в 1-й группе - 1926 нмоль/сут (1497; 4472) (мин. 1286 нмоль/сут, макс. 6800 нмоль/сут). Концентрация АКТГ в крови утром у пациентов 2-й группы составила 82 пг/мл (64; 115,2) (мин. 39,6 пг/мл; макс. 239,0 пг/мл); в 1-й группе - 59,7 пг/мл (51,6; 116,2); (мин. 43,5 пг/мл, макс. 155 пг/мл). Концентрация в крови АКТГ вечером составила у пациентов 2-й группы - 68,9 пг/мл (36,6; 86,3) (мин. 18,0 пг/мл; макс. 245,0 пг/мл), у пациентов 1-й группы - 54 пг/мл (40; 78,15) (мин. 28,4 пг/мл, макс. 100 пг/мл).

На втором этапе исследования были включены еще 14 пациентов, таким образом в анализ вошли 39 больных с БИК (табл. 2) в возрасте 36±10,5 года (Me 36 [29; 47]); (мин. 16 лет, макс 55 лет) из них 10 мужчин и 29 женщин. В 1-ю группу пациентов (у которых аденома не визуализировалась при МРТ) вошли 17 человек; во 2-ю группу -22, сопоставимых по полу и возрасту. Размер аденом на МРТ изображениях составил в среднем 6 мм (4,5; 10) (в среднем 8 мм - мин. 2; макс. 25 мм), включая 6 макроаденом, размером от 10 до 25 мм (Ме = 13 мм).

Содержание кортизола в суточной моче во 2-й группе составило 1536 нмоль/сут (1125,4; 2148,0) (мин. 602,3 нмоль/сут, макс. 2289 нмоль/сут), концентрация АКТГ утром - 76,6 пг/мл (59,02; 95,5) (мин. 39,6 пг/мл, макс. 115,2 пг/мл), концентрация АКТГ вечером - 71,6 пг/мл (51,4; 82,0) (мин. 32,9 пг/мл, макс. 109,5 пг/мл). В 1-й группе содержание кортизола в суточной моче составило 1708 нмоль/сут (1497; 1926) (мин. 1286 нмоль/сут; макс. 2144 нмоль/сут), содержание в крови АКТГ утром - 59,7 пг/мл (51,6; 107,3) (мин. 43,5 пг/мл, макс. 155 пг/мл), содержание в крови АКТГ вечером - 51,7 пг/мл (40,0; 51,4) (мин. 28,4 пг/мл, макс. 100 пг/мл).

В ходе первого этапа исследования во всех кортикотропинах (20 микроаденом; 5 макроаденом) было отмечено наличие кровеносных сосудов, тогда как лимфатические сосуды присутствовали лишь в половине случаев. Не было выявлено разницы между группами по количеству кровеносных сосудов, по диаметру самого крупного сосуда в срезе и по значению индекса пролиферации Ki-67 (p>0,05) (см. табл. 2). Однако средний диаметр кровеносных сосудов был значимо больше в образцах тканей пациентов первой группы (в которой опухоль не была визуализирована) (см. табл. 2). Мы не получили значимой разницы в количестве лимфатических сосудов между группами, однако наблюдалась тенденция (p=0,08) к большему их количеству в ткани аденом пациентов первой группы (см. табл. 2).

Учитывая полученные различия, выборка была увеличена с целью проверки гипотезы о влиянии ангиогенеза на возможность визуализации аденом гипофиза при МРТ с контрастным усилением.

При морфологической оценке удаленного материала было выявлено 26 аденом гипофиза (рис. 1), в 13 случаях мы наблюдали сочетание аденомы c гиперплазией аденогипофиза. Клеточный состав образований был представлен в 23 случаях базофильными клетками, в 11 - эозинофильными клетками, в 3 - состоял из эозинофильно-хромофобных клеток, в 2 - из базофильно-эозинофильных. Не было выявлено разницы между группами по клеточному составу и характеру новообразований (p>0,05). Пролиферативная активность в обеих группах была преимущественно низкой. Лишь в 3 образцах индекс пролиферации превышал 2% и был равен 3, 4 и 15%, соответственно.

В обеих группах подсчитывали количество кровеносных сосудов с оценкой их диаметра (рис. 2, 3, 4). Исследование лимфатического русла на большей выборке (биоматериал, включенный в исследование на втором этапе) не проводилось. В ходе второго этапа исследования мы не выявляли связи между визуализацией аденомы гипофиза при МРТ и состоянием сосудистого русла новообразования (табл. 4)

Количество сосудов на единицу площади и диаметр кровеносных сосудов в аденомах гипофиза у пациентов с БИК не влияет на возможность визуализации аденомы при МРТ.

Невозможность визуализации аденомы при МРТ является серьезной проблемой при диагностическом поиске причины АКТГ-зависимого гиперкортицизма. Для решения этой проблемы разработаны методы забора образцов крови, оттекающей от гипофиза [9], проводят поиск новых биомаркеров диагностики центрального гиперкортицизма [10], предлагают проводить МРТ с большей разрешающей способностью.

Возможной причиной отсутствия накопления контрастного препарата в ткани аденомы могла бы быть особенность строения сосудов в опухоли. Вместе с тем в настоящем исследовании нам не удалось выявить различий в количестве сосудов на единицу площади среза ткани аденомы и их диаметре в тех случаях, когда опухоль удалось визуализировать с помощью МРТ и в тех, когда этого не удалось. Выявленные на первом этапе исследования различия в среднем диаметре сосудов могли бы объяснять «сброс» контрастного препарата или меньшее его накопление в опухолях, которые не визуализируются при МРТ [11]. Однако при дальнейшем наборе материала (исследование проведено в два этапа ввиду редкости заболевания) и увеличении размера выборки выявленные различия оказались незначимыми.

Необходимо учитывать, что только у 20% пациентов с этой редкой патологией аденома не визуализируется при МРТ с контрастным усилением. Объем удаленной в ходе операции опухоли в этих случаях, как правило, сопоставим с объемом визуализирующихся аденом гипофиза, однако возникают объективные сложности с получением материала для гистологического исследования, связанные с потерей ткани в ходе нейрохирургических манипуляций. Мы не нашли в литературе данных для сравнения с нашими результатами, поскольку исследования строения и свойств сосудов ранее проводилась в основном в макроаденомах гипофиза (в нашем исследовании лишь 27% опухолей приходилось на макроаденомы) [12, 13]. К тому же, в таких исследованиях применялась разная методика оценки свойств сосудов, отличались и единицы площади исследуемых областей, что прежде всего связано с разным оптическим разрешением микроскопов и программным обеспечением.

Широко используемым методом оценки строения и свойств сосудов в опухолях человека является подсчет микрососудов с помощью специфических маркеров эндотелиальных клеток, таких как CD31 и CD34. Выбор иммуногистохимического маркера для оценки строения и свойств сосудов аденом основан на опыте ранее проведенных работ [12-14].

Что касается метода подсчета сосудов, то в большинстве исследований применяется метод N. Weidner и соавт. [15, 16], основанный на выборе поля зрения с максимальным количеством сосудов при малом увеличении для дальнейшего расчета средней плотности сосудов в нескольких полях зрения при большем увеличении.

Существуют рекомендации по оценке плотности микрососудов в опухолевой ткани, но важную роль играет опытность исследователя [12, 15, 16].

Попытка облегчить исследование опухолевого ангиогенеза была предпринята С. Fox и соавт. [17]. Данные, полученные с помощью использованного этими авторами метода, коррелировали с результатами применения метода N. Weidner. На выбранных «горячих точках» при увеличении ×200-250 25 случайно расположенных точек располагают так, чтобы максимальное их число содержалось внутри области окрашенных сосудов. Вместо отдельных микрососудов подсчитывают количество точек, лежащих вне этой области.

Полуавтоматический метод подсчета сосудов более удобен для оценки внутриопухолевой плотности сосудов. Основное преимущество компьютерной системы анализа изображения состоит в возможности оценки дополнительных морфологических параметров: количества сосудов внутри заранее заданной площади, и определение площади просвета сосудов.

При гистологическом исследовании аденогипофиз состоит из эпителиальных клеток, в промежутках между которыми лежат капилляры. Немногочисленные фибробласты образуют ретикулярные волокна, которые поддерживают тяжи секретирующих гормоны клеток. Наличие ретикулиновых волокон имеет большое значение, поскольку они присутствуют в нормальном и гиперплазированном аденогипофизе, но отсутствуют в аденомах [18]. Поэтому с целью дифференциальной диагностики аденомы от гиперплазированной ткани аденогипофиза полезно применение гистологической окраски на ретикулиновые волокна.

В наших случаях клеточный состав новообразований был в основном представлен базофильными клетками, которые в норме продуцируют АКТГ; редко встречалась примесь стволовых хромофобных клеток. В 35% случаев мы отмечали образования из эозинофильных клеток, которые в норме не продуцируют АКТГ. Это может могут быть обусловлено «приобретением» ацидофильной окраски базофильными клетками вследствие увеличения в них количества митохондрий, приобретением онкоцитарной дифференцировки или «полипотентностью» неопластических эозинофильных клеток [19].

В 2 случаях мы наблюдали в неизмененном гипофизе клетки Крука, которые выявляются у пациентов с гиперкортицизмом, и представляют собой гиалинизированную базофильную клетку с накоплением цитокератинов в перинуклеарной области. Такие изменения чаще всего встречаются в прилежащем к кортикотропиноме нормальном аденогипофизе, но могут быть выявлены и в агрессивных аденомах [20].

Индекс пролиферации Ki-67 в АКТГ-секретирующих аденомах гипофиза в нашем исследовании варьировал от 0 до 3% и лишь в одном случае достигал 15%. Несмотря на то что Ki-67 >3% ассоциирован со злокачественным потенциалом, наблюдение за этим больным в течение года не выявило признаков злокачественного роста.

Нам не удалось выявить каких-либо гистологических особенностей невизуализирующихся АКТГ-секретирующих аденом гипофиза.

Определенное влияние на полученные результаты мог оказать не слишком значительный объем выборки. Однако значения p достаточно велики, чтобы связывать отсутствие различий между группами исключительно с объемом выборки. Кроме того, в работу могли быть включены невизуализированные с помощью МРТ аденомы гипофиза большего размера. Оценить точный размер аденомы, которая не визуализировалась при МРТ, не представляется возможным ввиду того, что удаленный материал не обязательно состоит только из ткани опухоли, а ткань опухоли могла быть полностью или частично утеряна при хирургических манипуляциях. Наконец, существуют ограничения подсчета сосудов: форма сосудов различна и не всегда имеет правильные геометрические контуры; не ясно, можно ли считать близко расположенные структуры отдельными сосудами. Подсчет сосудов - кропотливый процесс, их количество при анализе различными специалистами может различаться.

Не выявлено связи между характеристиками кровеносного русла аденом гипофиза и возможностью их визуализации с помощью МРТ с контрастным усилением.

Источники финансирования. Исследование проведено за счет средств гранта Российского Научного Фонда (проект № 15−15−30032).

Участие авторов: сбор клинического материала, подбор блоков, написание текста статьи - П.М. Хандаева; разработка дизайна исследования, иммуногистохимия, анализ результатов, написание текста - И.В. Воронкова; идея работы, разработка дизайна исследования, анализ результата, коррекция текста - Ж.Е. Белая; общая идея работы, коррекция текста, обсуждение результатов - Л.Я. Рожинская и Г.А. Мельниченко; МРТ-исследование, анализ результатов - А.В. Воронцов; нейрохирургические манипуляции, сбор послеоперационного материала, обсуждение и анализ результатов - А.Ю. Григорьев

Благодарности

Авторы признательны Ю.И. Филиппову за внимательное прочтение статьи, конструктивную критику и замечания.