Особенности кислородного и антиоксидантного статуса крови на фоне заместительной терапии гормоном роста у детей с соматотропной недостаточностью

Связь между дефицитом гормона роста (ГР) и повышенной смертностью от заболеваний сердечно-сосудистой системы у взрослых лиц отмечена давно [1]. Дефицит ГР сопровождается изменениями липидного состава крови и инсулинорезистентностью, что увеличивает риск повреждения сосудистой стенки, развития атеросклероза и других заболеваний сердечно-сосудистой системы [2, 3]. Одним из главных механизмов повреждения эндотелиоцитов является окислительный стресс, обусловленный нарушением равновесия между продукцией активных форм кислорода (АФК) и возможностями антиоксидантной системы клетки. Умеренные количества АФК являются частью нормального метаболизма и производятся in vivo фагоцитами, эндотелиоцитами, фибробластами и миоцитами [4]. При чрезмерной продукции АФК наблюдается повреждение клеток (прежде всего клеточной мембраны) вследствие перекисного окисления липидов и липопротеинов, приводящее к их гибели. В эксперименте продемонстрирована повышенная резистентность к окислительному стрессу у карликовых крыс после курса лечения препаратами ГР [5].

Влияние терапии ГР на состояние антиоксидантной защиты при соматотропной недостаточности привлекает пристальное внимание [6, 7].

Важно выяснить, насколько эффективно обеспечиваются кислородом органы и ткани у детей с соматотропной недостаточностью при значительном увеличении линейного роста на фоне терапии ГР.

Помимо изменения кислородного статуса возможно прямое влияние ГР и инсулиноподобного ростового фактора 1 (ИФР-1) на эритроцитарную функцию [8]. В экспериментах in vitro и на биологических моделях было показано стимулирующее действие гормона на эритропоэз и гранулоцитопоэз, сопровождавшееся увеличением концентрации гемоглобина в крови [9], а также на объем циркулирующей крови, количество эритроцитов и их способность к агрегации [10, 11]. Влияние ГР на морфологию эритроцитов, в частности, на возможность физиологической деформации клеток изучалось на биологических моделях и у здоровых добровольцев [11], однако полученные результаты немногочисленны и противоречивы.

Изменение кислородного статуса может служить триггером окислительного стресса, что в свою очередь может влиять на метаболические процессы в организме. Оценку кислородного статуса наиболее удобно проводить при помощи спектроскопии комбинационного рассеяния (КР-спектроскопии), позволяющей регистрировать состояние гемоглобина непосредственно в эритроцитах нативной крови в естественном окружении плазмы с собственным значением рН, содержанием газов, белков и белково-липидных комплексов.

При увеличения скорости линейного роста также возможно ускорение метаболических процессов, что само по себе или в сочетании с сопутствующим изменением кислородного статуса стимулирует защитные ресурсы организма, в том числе через усиление окислительных процессов и образование АФК, а также других свободных радикалов, накопление которых инициирует дополнительную активацию антиоксидантных систем.

Для оценки антиоксидантного статуса крови нами были выбраны наиболее полно характеризующие его показатели: супероксиддисмутазная активность, каталазная активность [12], уровень небелковых тиолов, уровень церулоплазмина, количество конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), оцениваемого по уровню соединений, связанных с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-АП) [13]. Супероксиддисмутаза и церулоплазмин ответственны не только за утилизацию супероксид анион-радикала, но и регулируют уровень металлов переменной валентности (меди и железа); каталаза и небелковые тиолы принимают участие в утилизации перекиси водорода, а увеличение уровня продуктов ПОЛ отражает развитие окислительного стресса.

Изменение кислородного статуса и стресс нарушают характеристики эритроцитов, что можно выявить при общем клиническом анализе, а также путем оценки морфологических изменений клеток с помощью лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ) [14].

Не исключено, что в начальном периоде терапии ГР у детей с соматотропной недостаточностью возникает адаптация организма к максимальному ускорению роста, проявляющаяся, в частности, изменением морфофункциональных свойств эритроцитов.

Цель исследования — изучение системного влияния краткосрочной терапии рекомбинантным ГР на кислородный и антиоксидантный статус крови у детей с соматотропной недостаточностью.

В исследовании приняли участие 11 пациентов (2 девочки и 9 мальчиков в возрасте от 3 до 9 лет) с соматотропной недостаточностью, не получавших ранее терапию ГР. С изолированной формой ГР-дефицита — 10 человек, с множественным дефицитом гормонов аденогипофиза (МДГА) — 1 человек (СТГ/ТТГ). Хронологический возраст (ХВ) составлял 6,1±2,2 года, костный возраст (КВ) — 2,6±0,9 года.

Всем пациентам проводилось стандартное клинико-лабораторно-инструментальное обследование на базе ЭНЦ, включавшее физикальное обследование и антропометрию, рентгенографию кисти с лучезапястным суставом (при включении в исследование), МРТ или КТ головного мозга (при включении в исследование). Для верификации диагноза ГР-стимулирующие пробы: с клофелином — определение ГР в 5 точках (0, 30, 60, 90 и 120 мин) и с инсулином — определение ГР в 7 точках (0, 15, 30, 45, 60, 90 и 120 мин). Лабораторные исследования [общий и биохимический анализ крови, исследование уровня ИРФ-1 и связывающего инсулиноподобный ростовый фактор белка 3 (ИРФСБ-3)] проводили перед началом лечения и через 3 мес терапии. Рекомбинантный ГР вводили подкожно ежедневно 1 раз в день (вечером, перед сном). Доза препарата составляла 0,033 мг на 1 кг массы тела в день.

Исследование антиоксидантного и кислородного статуса проводили в пробах цельной крови, отбираемых натощак, до начала и через 3 мес терапии ГР (кафедра биофизики МГУ им. М.В. Ломоносова) с использованием спектроскопии комбинационного рассеяния (КР), лазерной интерференционной микроскопии и биохимического анализа показателей антиоксидантного статуса.

Спектроскопия комбинационного рассеяния. Данный метод использовался для исследования конформации гемопорфирина (ГП), позволяющий оценить изменения лигандсвязывающих свойств гемоглобина. Стеклянный капилляр с цельной кровью помещали в ячейку спектрометра и фокусировали на нем луч лазера (λ=473 нм, Р=18—20 мВт). Для каждой пробы отбирали 3 капилляра, каждый из которых оценивали независимо; полученные значения усреднялись. Измеренный в таких условиях спектр КР крови в диапазоне 1200—1700 см^-1(рис. 1)

Лазерная интерференционная микроскопия. Морфологические характеристики клеток исследовали методом лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ) [14] в условиях in vitro. Методика приготовления образцов описана ранее [16]. В каждой пробе оценивали не менее 100 клеток. Для обработки изображений использовали программу FIJI [17]. Состояние эритроцитов характеризовали морфологическим индексом (МИ) [18]. При расчете МИ каждой форме эритроцита присваивается определенная сумма баллов (рис. 2).

Биохимические методы. Антиоксидантная активность цельной крови оценивали по изменению супероксиддисмутазной и каталазной активности и по количеству небелковых тиолов; в плазме определяли количество церулоплазмина и ТБК-активных продуктов (продукты гомолитического распада, реагирующие с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП).

Статистическая обработка проводилась с помощью пакета статистических программ Statistica 6.0. Данные представлены в виде M±SD. При сравнении параметров до и через 3 мес лечения использовали непараметрический критерий Уилкоксона. Корреляционные связи оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Статистически значимыми считались изменения при р<0,05.

Основные антропометрические и лабораторные показатели детей с соматотропной недостаточностью до и на фоне 3 мес заместительной терапии ГР приведены в табл. 2.

Основные морфофункциональные характеристики эритроцитов у обследуемых пациентов до и на фоне терапии представлены в табл. 3.

Количество эритроцитов, общее количество гемоглобина, а также объем эритроцитов (MCV) практически не изменялись, однако наблюдалось статистически значимое уменьшение MCH (средняя концентрация гемоглобина) и MCHС (средняя концентрация гемоглобина в эритроците). Таким образом, можно говорить о развитии незначительной анемии как адаптивной реакции организма. Эритроциты пациентов были представлены главным образом дискоцитами и эхиноцитами первого типа, реже стоматоцитами различных типов и эхиноцитами второго и третьего типов. За период терапии наблюдалась тенденция к увеличению МИ эритроцитов.

При измерениях методом КР-спектроскопии было установлено значимое уменьшение содержания комплексов Hb-NO (характеризующихся связью атома Fe²⁺ с глобином). Oксид азота играет важную роль в регуляции транспорта O₂ эритроцитами и обмена O₂ в тканях [19]. Важно то, что, синтезируясь в определенном месте, NO переносится гемоглобином по всему организму [20]. Константа сродства NO к атому железа (Fe²⁺) порфирина на 5—7 порядков выше, чем O₂, и поэтому NO способен конкурировать с кислородом за связывание гемоглобином [21]. Связываясь с атомом Fe²⁺ гемоглобина, NO способен изменять конформацию гемопорфирина гемоглобина и менять сродство гемоглобина к O₂ [20]. Экзогенный NO может увеличивать выделение O₂ из эритроцитов [19]. Таким образом, уменьшение доли NO способствует увеличению доли оксигемоглобина в крови, что и подтверждается экспериментально. Действительно, в процессе терапии наблюдалась тенденция к увеличению содержания оксигемоглобина в эритроцитах, способность гемоглобином связывать лиганды уменьшалась, имело место также уменьшение сродства гемоглобина к кислороду.

Различия в отношениях, характеризующих способность гемоглобина связывать кислород и сродство гемоглобина к кислороду, по сравнению с аналогичными показателями до начала терапии могут быть частично объяснены увеличением доли окси- и соответственно уменьшением доли дезоксигемоглобина в эритроците. Тенденция к увеличению доли оксигемоглобина, возможно, является адаптивным механизмом, направленным на сохранение кислорода в организме при уменьшении его количества в клетках.

Изменения основных маркеров антиоксидантной системы у обследуемых пациентов представлены в табл. 4.

Нами выявлены статистически значимые корреляции ряда исследуемых параметров: отрицательная корреляция между относительным количеством комплексов NO с гемоглобином и содержанием оксигемоглобина (r=–0,79; p<0,05) и положительная корреляция данных комплексов с концентрацией гемоглобина (r=0,67; p<0,05). Отмечена положительная корреляция (r=0,64; p<0,05) между изменениями SDS скорости роста и оксигемоглобина, т.е. чем выше скорость роста, тем больше доля оксигемоглобина. Также имелась отрицательная корреляция между МСНС (средней концентрацией гемоглобина в эритроците) и SDS скорости роста (r=–0,69; p<0,5).

Коэффициент корреляции между активностью каталазы и концентрацией ИФРСБ-3 составил –0,67 (p<0,05), а между относительным содержанием оксигенированного гемоглобина и МИ — 0,67 (p<0,05). Выявлена отрицательная корреляция между содержанием оксигемоглобина и концентрацией ИФР-1 (r=–0,72; p<0,05).

Обнаруженные значимые корреляции показателей роста, ростовых факторов и показателей кислородного и антиоксидантного статуса свидетельствуют о взаимосвязи между системой ГР—ИФР-1 и функциональными свойствами эритроцитов, отражающей в первую очередь развитие адаптивных механизмов в ответ на увеличение линейного роста.

Полученные данные свидетельствуют о взаимосвязи системы ГР—ИФР-1 с морфофункциональным состоянием эритроцитов. На фоне краткосрочной терапии ГР у детей с соматотропной недостаточностью отмечается формирование адаптивных механизмов, препятствующих развитию гипоксии и окислительного стресса.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — М.С. Панкратова, А.И. Юсипович, Т.Ю. Ширяева, Г.В. Максимов, В.А. Петеркова, И.И. Дедов

Сбор и обработка материала — М.С. Панкратова, А.И. Юсипович, М.В. Воронцова, С.С. Коваленко, А.А. Байжуманов, Е.Ю. Паршина, Т.Ю. Ширяева

Статистическая обработка данных — М.С. Панкратова, А.И. Юсипович, С.С. Коваленко, А.А. Байжуманов

Написание текста — М.С. Панкратова, А.И. Юсипович, М.В. Воронцова, С.С. Коваленко

Редактирование — Т.Ю. Ширяева, Г.В. Максимов, В.А. Петеркова, И.И. Дедов

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Статья выполнена в рамках реализации Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 гг.