Синтез и исследование влияния новых аналогов эксенатида на уровень гликемии и функции почек у крыс

В экспериментах на млекопитающих [1] и клинических исследованиях [2] показана роль глюкагоноподобного пептида 1 (ГПП-1) в нормализации уровня глюкозы в крови. Установлено, что этот пептид и его миметик (эксенатид) способствуют секреции инсулина и достижению нормогликемии [3]. Фармакологические средства (Баета) [4], созданные на их основе, оказались эффективны в терапии сахарного диабета 2-го типа [5, 6]. Введение ГПП-1 снижает потребление пищи и воды [7], усиливает выведение натрия почкой [8]. В литературе нет детальных исследований влияния эксенатида на различные функции почек, хотя это представляет очевидный интерес в связи с таким осложнением сахарного диабета, как нефропатия и рядом побочных эффектов Баеты. Важно было установить, в какой степени влияние эксенатида на функцию почки зависит от прямого его воздействия на клетки эпителия, и в какой — обусловлено действием иных веществ. Учитывая физиологическое и клиническое значение эксенатида, представлялось интересным синтезировать его новые аналоги и выяснить влияние эксенатида и его аналогов на гликемию и функциональное состояние почек. Это и являлось задачей нашей работы.

Исследование выполнено на 4—6-месячных самках крыс Вистар массой 150—220 г и на изолированной коже и мочевых пузырях самцов лягушки Rana temporaria L. (масса тела 20—30 г) в период с января по март. Крыс содержали в виварии при стандартных условиях. Утром в день, предшествующий эксперименту, крысы получали корм, затем до опыта им не давали пищи при свободном доступе к воде. Протокол исследования одобрен этическим комитетом ИЭФБ РАН.

Влияние аналогов эксенатида на концентрацию глюкозы в плазме крови. Эксперименты проведены на наркотизированных крысах, что исключало влияние стресса (взятие проб крови) на уровень глюкозы. Наркоз осуществляли внутрибрюшинно введением 0,6 мл на 100 г массы тела смеси 0,75% нембутала и 0,37% хлоралозы. Через 30 мин брали каплю капиллярной крови из хвоста для определения концентрации глюкозы с помощью тест-полосок на глюкометре Accu-Сhek Go («Roche», Швейцария).

Эксенатид и его аналоги растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия до концентрации 0,25—1,2 нмоль/мл и инъецировали в/м в объеме 0,1 мл на 100 г массы тела. Животным контрольной группы вводили тот же объем 0,9% раствора хлорида натрия. Через 15 мин после введения препаратов проводили тест на толерантность к глюкозе [9]: внутрибрюшинно вводили 0,3 мл на 100 г массы тела 50% раствора глюкозы, контрольным животным — внутрибрюшинно 0,3 мл на 100 г массы тела 0,9% раствора хлорида натрия. Через 15, 30 и 60 мин после введения глюкозы у крыс брали пробы крови для определения концентрации глюкозы.

Влияние эксенатида и его аналогов на функции почек. Опыты выполнены на ненаркотизированных крысах. Эксенатид и его аналоги вводили внутримышечно в объеме 0,1 мл на 100 г массы тела в дозах 0,005—0,5 нмоль на 100 г массы тела, крысы контрольной группы получали 0,9% раствор хлорида натрия. Животных помещали в клетки-пеналы с проволочным дном, откуда моча стекала по воронке в пробирку. Измеряли спонтанный диурез. Кровь брали по окончании эксперимента из сонной артерии под эфирным наркозом.

В пробах сыворотки и мочи определяли осмоляльность на микроосмометре 3300 («Advanced Instruments, Inc.», США), концентрацию Na+ и K+ — на пламенном фотометре Corning-410 (Великобритания) в воздушно-пропановом пламени, Mg2+ — в воздушно-ацетиленовом пламени на атомном абсорбционном спектрофотометре Hitachi-508 (Япония), концентрацию креатинина — кинетическим методом по реакции Яффе на автоматическом биохимическом анализаторе EOS Bravo W (Италия) с применением реактивов фирмы «Randox». При фотометрии и спектрофотометрии использованы стандарты фирмы «Aldrich Chemical Company Inc.» (США).

Исследование действия эксенатида на транспорт натрия в коже лягушки. Действие эксенатида на транспорт натрия в коже лягушки исследовали путем измерения короткозамкнутого тока на установке EVC-4000 («World Precision Instruments», США). С обеих сторон изолированной кожи брюшка лягушки находился аэрируемый раствор, соответствующий физико-химическим характеристикам плазмы крови лягушек в данное время года. Физиологический раствор готовили с добавлением на 1 кг воды 6,5 г NaCl, 0,25 г KCl, 0,2 г NaHCO₃, 0,9 г глюкозы, 0,19 мл 10% раствора CaCl₂; осмоляльность 225 мОсм/кг Н₂О рН 7,6. Опыты проводили при 22—24 °С. Эксенатид и аргинин-вазопрессин («Sigma Chemical Co», США) разводили в этом же физиологическом растворе без добавления кальция до концентрации 1 и 0,1 мкмоль/л соответственно. Препараты добавляли к внутренней стороне кожи лягушки.

Исследование действия эксенатида на транспорт воды в мочевом пузыре лягушки. Со стороны серозной оболочки мочевых пузырей находился аэрируемый физиологический раствор (225 мОсм/кг Н₂О), со стороны слизистой оболочки — гипотонический раствор (25 мОсм/кг Н₂О). Осмотическую проницаемость рассчитывали по потоку воды по осмотическому градиенту в мкл/мин на 1 см² площади поверхности мочевого пузыря [10]. Одна из долей мочевого пузыря служила контролем; к ней со стороны серозной оболочки добавляли аргинин-вазопрессин 10–8 М («Sigma Chemical Co», США); к другой доле перед добавлением аргинин-вазопрессина в раствор вносили 10–9 М эксенатида.

Синтез аналогов эксенатида. Аналоги эксенатида с заменой метионина в 14-м положении на норлейцин, аланина в положении 35 на D-аланин и серина в 39-м положении на серинол были получены с использованием как конвергентного твердофазного метода, так и классического синтеза в растворе:

Эксенатид: HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnMetGluGluGluAlaVal ArgLeu PheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyProSerSerGlyAlaProProProSer-NH2.

Аналог I (14-норлейцин,39-серинол-эксенатид): HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnNleGluGluGluAlaValArgLeuPheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyProSerSerGlyAlaProProProSer-ol.

Аналог II (14-норлейцин,35-D-аланин,39-серинол-эксенатид): HisGlyGluGlyThr PheThrSerAspLeuSerLysGlnNleGluGluGluAlaValArgLeuPheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyProSerSerGlyD-AlaProProProSer-ol.

39-Аминокислотная последовательность была разбита на фрагменты с учетом специфики аминокислотных остатков. Фрагменты синтезировали твердофазным методом с использованием Fmoc-/tBu-стратегии на 2-хлортритилхлоридной смоле; восстановление карбоксильной группы фрагмента 35—39 борогидридом натрия проводили в растворе. Финальная конденсация фрагментов 1—34 и 35—39 проходила в растворе, степень протекания реакции контролировали с помощью обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Полное деблокирование защитных групп пептидной цепи проводили в смеси TFA:TIS:H2O в соотношении 95:2,5:2,5 в течение 2 ч при комнатной температуре. Анализ полученных продуктов методом обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии в системе ацетонитрил—вода (0,1% TFA) при 42 °С показал 75—80% содержание целевых пептидов в смеси. После очистки с помощью обращеннофазной (С18) препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии были получены аналоги эксенатида с чистотой 98% (I) и 97% (II). Пики молекулярных ионов в масс-спектрах MALDI-TOF соответствовали расчетным.

Статистическую обработку проводили с использованием программы Statistica 6.0. Все данные представлены в виде M±m. Значимость различий показателей между группами оценивали по тесту ANOVA и критерию Ньюмена—Кейлса для множественных сравнений (при p<0,05). Достоверность различий проницаемости парных мочевых пузырей оценивали по t-критерию Стьюдента для попарно связанных вариант.

Влияние аналогов эксенатида на уровень гликемии в условиях нагрузки глюкозой. Изменение функции почек при сахарном диабете вызвано рядом причин, в том числе осмотическим диурезом, связанным либо с избыточным поступлением глюкозы при гломерулярной фильтрации в просвет проксимального канальца нефрона, либо с уменьшением ее реабсорбции. В исходном состоянии у крыс концентрация глюкозы в плазме составляет 6,2±0,3 ммоль/л. После внутрибрюшинного введения 0,3 мл на 100 г 50% раствора глюкозы ее концентрация в плазме почти удваивалась и постепенно к концу 1-го часа возвращалась к исходному значению (табл. 1).

Для сравнения стабильности синтезированных препаратов и эксенатида водные буферные растворы аналогов I и II инкубировали при 40 °С и pH 7,0 в течение 3 мес. Аликвоты растворов периодически отбирали и анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. За весь период исследования деградация пептидов не превышала 3%, тогда как деградация эксенатида составляла около 10% в течение 1 мес [11]. Таким образом, к достоинству новых синтезированных пептидов следует отнести их большую, чем у эксенатида, устойчивость в водных растворах при равной с эксенатидом гипогликемической активности на фоне нагрузки глюкозой.

Влияние аналогов эксенатида на функции почек. После инъекции крысам эксенатида или его аналогов в дозе 0,05 нмоль на 100 г возрастало мочеотделение. В течение первого получаса оно достигало максимума, затем постепенно снижалось до исходного уровня (рис. 1).

Таким образом, эксенатид и аналоги I и II обладают высокой, ранее неизвестной селективной ионорегулирующей и диуретической активностью. Клинически важным является усиление экскреции жидкости и натрия почкой в сочетании со слабым влиянием на выделение калия из организма, поскольку это благоприятствует нормализации водно-солевого обмена и не вызывает неблагоприятных побочных эффектов, связанных с гипокалиемией.

Влияние вазопрессина и эксенатида на осмотическую проницаемость мочевого пузыря лягушки. Важно было выяснить, действует ли эксенатид на функции почек прямо или опосредованно физиологически активными веществами, выделяющимися в кровь под его влиянием (подобно тому, как это происходит в случае инсулина). Для ответа на этот вопрос были проведены опыты на эпителии кожи и мочевого пузыря лягушки. Мочевой пузырь амфибий является принятым тест-объектом при изучении регуляции проницаемости эпителия для воды и влияния вазопрессина. Существенно, что молекулярные механизмы увеличения реабсорбции воды в эпителии собирательных трубочек почки и мочевого пузыря лягушек практически сходны. В этих опытах эксенатид не влиял на осмотическую проницаемость ни сам по себе, ни при одновременном введении аргинин-вазопрессина (рис. 4).

Влияние вазопрессина и эксенатида на транспорт натрия в коже лягушки. Эпителий кожи лягушки служит тест-объектом при изучении действия гормонов и лекарственных средств на транспорт натрия в дистальных сегментах нефрона. Добавление 10^-6 М эксенатида к раствору с внутренней стороны кожи, где располагаются кровеносные сосуды, не снижало значений тока короткого замыкания; напротив, наблюдалась тенденция к его увеличению (рис. 5).

Таким образом, новые синтезированные аналоги эксенатида сопоставимы с эксенатидом по гликемическому эффекту, но обладают большей устойчивостью в растворе, что может придавать им определенные преимущества. В литературе практически нет данных об изменении деятельности почек под влиянием эксенатида. В нашей работе установлен ряд положительных (с клинической точки зрения) эффектов этих пептидов — диуретическое и натрийуретическое действие в сочетании с сохранением калия в организме. Особенно важно впервые обнаруженное нами влияние эксенатида на осморегулирующую функцию почек и выведение осмотически свободной воды, т.е. его способность стабилизировать осмотический гомеостаз.

В нашей работе показано, что влияние эксенатида на функции почек зависит от вовлечения неизвестных эндогенных, возможно, эндокринных факторов. Нормализация гликемии при участии ГПП-1 и эксенатида зависит от их способности усиливать секрецию инсулина в условиях повышенной концентрации глюкозы в крови. Исследования на эпителии кожи и мочевого пузыря, функционально подобных клеткам дистального сегмента нефрона, свидетельствуют о том, что в исходном состоянии и в присутствии аргинин-вазопрессина эксенатид не влияет на систему реабсорбции воды и натрия ex vivo. Следовательно, те эффекты, которые постоянно проявляются in vivo, могут быть опосредованы секрецией физиологически активных веществ, меняющих функцию почек. Таким образом, речь может идти не только о синтезе новых эффективных аналогов эксенатида, но и о новых сторонах его функциональной активности в эндокринной системе.

1. Синтезированы аналоги эксенатида с заменой аминокислотных остатков в 14-м, 35-м, 39-м положениях.

2. Аналоги подобно эксенатиду оказывают гипогликемический эффект при гипергликемии.

3. Синтезированные аналоги эксенатида обладают большей устойчивостью в растворе.

4. Эксенатид и его аналоги усиливают выведение почкой натрия, магния и осмотически свободной воды в сочетании с сохранением ионов калия.

5. Эксенатид не оказывает прямого ингибирующего влияния на транспорт натрия и воды на изолированной коже и мочевых пузырях лягушки. Его действие in vivo, вероятно, опосредовано образованием физиологически активных веществ.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 08-04-00610), программ «Ведущие научные школы» (проект НШ-65100.2010.4) и ОБН РАН.