Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Боголепова А.Е.

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Кутина А.В.

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Марина А.С.

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Никольская С.К.

Санкт-Петербургский государственный университет

Шахматова Е.И.

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Титов М.И.

Санкт-Петербургский государственный университет

Наточин Ю.В.

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Синтез и исследование влияния новых аналогов эксенатида на уровень гликемии и функции почек у крыс

Авторы:

Боголепова А.Е., Кутина А.В., Марина А.С., Никольская С.К., Шахматова Е.И., Титов М.И., Наточин Ю.В.

Подробнее об авторах

Журнал: Проблемы эндокринологии. 2011;57(3): 42‑47

Просмотров: 208

Загрузок: 1

Как цитировать:

Боголепова А.Е., Кутина А.В., Марина А.С., Никольская С.К., Шахматова Е.И., Титов М.И., Наточин Ю.В. Синтез и исследование влияния новых аналогов эксенатида на уровень гликемии и функции почек у крыс. Проблемы эндокринологии. 2011;57(3):42‑47.
Bogolepova AE, Kutina AV, Marina AS, Nikol'skaia SK, Shakhmatova EI, Titov MI, Natochin IuV. Synthesis of new exenatide analogs and investigation of their influence on glycemia and renal function in rats. Problemy Endokrinologii. 2011;57(3):42‑47. (In Russ.).

?>

В экспериментах на млекопитающих [1] и клинических исследованиях [2] показана роль глюкагоноподобного пептида 1 (ГПП-1) в нормализации уровня глюкозы в крови. Установлено, что этот пептид и его миметик (эксенатид) способствуют секреции инсулина и достижению нормогликемии [3]. Фармакологические средства (Баета) [4], созданные на их основе, оказались эффективны в терапии сахарного диабета 2-го типа [5, 6]. Введение ГПП-1 снижает потребление пищи и воды [7], усиливает выведение натрия почкой [8]. В литературе нет детальных исследований влияния эксенатида на различные функции почек, хотя это представляет очевидный интерес в связи с таким осложнением сахарного диабета, как нефропатия и рядом побочных эффектов Баеты. Важно было установить, в какой степени влияние эксенатида на функцию почки зависит от прямого его воздействия на клетки эпителия, и в какой — обусловлено действием иных веществ. Учитывая физиологическое и клиническое значение эксенатида, представлялось интересным синтезировать его новые аналоги и выяснить влияние эксенатида и его аналогов на гликемию и функциональное состояние почек. Это и являлось задачей нашей работы.

Материал и методы

Исследование выполнено на 4—6-месячных самках крыс Вистар массой 150—220 г и на изолированной коже и мочевых пузырях самцов лягушки Rana temporaria L. (масса тела 20—30 г) в период с января по март. Крыс содержали в виварии при стандартных условиях. Утром в день, предшествующий эксперименту, крысы получали корм, затем до опыта им не давали пищи при свободном доступе к воде. Протокол исследования одобрен этическим комитетом ИЭФБ РАН.

Влияние аналогов эксенатида на концентрацию глюкозы в плазме крови. Эксперименты проведены на наркотизированных крысах, что исключало влияние стресса (взятие проб крови) на уровень глюкозы. Наркоз осуществляли внутрибрюшинно введением 0,6 мл на 100 г массы тела смеси 0,75% нембутала и 0,37% хлоралозы. Через 30 мин брали каплю капиллярной крови из хвоста для определения концентрации глюкозы с помощью тест-полосок на глюкометре Accu-Сhek Go («Roche», Швейцария).

Эксенатид и его аналоги растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия до концентрации 0,25—1,2 нмоль/мл и инъецировали в/м в объеме 0,1 мл на 100 г массы тела. Животным контрольной группы вводили тот же объем 0,9% раствора хлорида натрия. Через 15 мин после введения препаратов проводили тест на толерантность к глюкозе [9]: внутрибрюшинно вводили 0,3 мл на 100 г массы тела 50% раствора глюкозы, контрольным животным — внутрибрюшинно 0,3 мл на 100 г массы тела 0,9% раствора хлорида натрия. Через 15, 30 и 60 мин после введения глюкозы у крыс брали пробы крови для определения концентрации глюкозы.

Влияние эксенатида и его аналогов на функции почек. Опыты выполнены на ненаркотизированных крысах. Эксенатид и его аналоги вводили внутримышечно в объеме 0,1 мл на 100 г массы тела в дозах 0,005—0,5 нмоль на 100 г массы тела, крысы контрольной группы получали 0,9% раствор хлорида натрия. Животных помещали в клетки-пеналы с проволочным дном, откуда моча стекала по воронке в пробирку. Измеряли спонтанный диурез. Кровь брали по окончании эксперимента из сонной артерии под эфирным наркозом.

В пробах сыворотки и мочи определяли осмоляльность на микроосмометре 3300 («Advanced Instruments, Inc.», США), концентрацию Na+ и K+ — на пламенном фотометре Corning-410 (Великобритания) в воздушно-пропановом пламени, Mg2+ — в воздушно-ацетиленовом пламени на атомном абсорбционном спектрофотометре Hitachi-508 (Япония), концентрацию креатинина — кинетическим методом по реакции Яффе на автоматическом биохимическом анализаторе EOS Bravo W (Италия) с применением реактивов фирмы «Randox». При фотометрии и спектрофотометрии использованы стандарты фирмы «Aldrich Chemical Company Inc.» (США).

Исследование действия эксенатида на транспорт натрия в коже лягушки. Действие эксенатида на транспорт натрия в коже лягушки исследовали путем измерения короткозамкнутого тока на установке EVC-4000 («World Precision Instruments», США). С обеих сторон изолированной кожи брюшка лягушки находился аэрируемый раствор, соответствующий физико-химическим характеристикам плазмы крови лягушек в данное время года. Физиологический раствор готовили с добавлением на 1 кг воды 6,5 г NaCl, 0,25 г KCl, 0,2 г NaHCO3, 0,9 г глюкозы, 0,19 мл 10% раствора CaCl2; осмоляльность 225 мОсм/кг Н2О рН 7,6. Опыты проводили при 22—24 °С. Эксенатид и аргинин-вазопрессин («Sigma Chemical Co», США) разводили в этом же физиологическом растворе без добавления кальция до концентрации 1 и 0,1 мкмоль/л соответственно. Препараты добавляли к внутренней стороне кожи лягушки.

Исследование действия эксенатида на транспорт воды в мочевом пузыре лягушки. Со стороны серозной оболочки мочевых пузырей находился аэрируемый физиологический раствор (225 мОсм/кг Н2О), со стороны слизистой оболочки — гипотонический раствор (25 мОсм/кг Н2О). Осмотическую проницаемость рассчитывали по потоку воды по осмотическому градиенту в мкл/мин на 1 см2 площади поверхности мочевого пузыря [10]. Одна из долей мочевого пузыря служила контролем; к ней со стороны серозной оболочки добавляли аргинин-вазопрессин 10–8 М («Sigma Chemical Co», США); к другой доле перед добавлением аргинин-вазопрессина в раствор вносили 10–9 М эксенатида.

Синтез аналогов эксенатида. Аналоги эксенатида с заменой метионина в 14-м положении на норлейцин, аланина в положении 35 на D-аланин и серина в 39-м положении на серинол были получены с использованием как конвергентного твердофазного метода, так и классического синтеза в растворе:

Эксенатид: HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnMetGluGluGluAlaVal ArgLeu PheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyProSerSerGlyAlaProProProSer-NH2.

Аналог I (14-норлейцин,39-серинол-эксенатид): HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnNleGluGluGluAlaValArgLeuPheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyProSerSerGlyAlaProProProSer-ol.

Аналог II (14-норлейцин,35-D-аланин,39-серинол-эксенатид): HisGlyGluGlyThr PheThrSerAspLeuSerLysGlnNleGluGluGluAlaValArgLeuPheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyProSerSerGlyD-AlaProProProSer-ol.

39-Аминокислотная последовательность была разбита на фрагменты с учетом специфики аминокислотных остатков. Фрагменты синтезировали твердофазным методом с использованием Fmoc-/tBu-стратегии на 2-хлортритилхлоридной смоле; восстановление карбоксильной группы фрагмента 35—39 борогидридом натрия проводили в растворе. Финальная конденсация фрагментов 1—34 и 35—39 проходила в растворе, степень протекания реакции контролировали с помощью обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Полное деблокирование защитных групп пептидной цепи проводили в смеси TFA:TIS:H2O в соотношении 95:2,5:2,5 в течение 2 ч при комнатной температуре. Анализ полученных продуктов методом обращеннофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии в системе ацетонитрил—вода (0,1% TFA) при 42 °С показал 75—80% содержание целевых пептидов в смеси. После очистки с помощью обращеннофазной (С18) препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии были получены аналоги эксенатида с чистотой 98% (I) и 97% (II). Пики молекулярных ионов в масс-спектрах MALDI-TOF соответствовали расчетным.

Статистическую обработку проводили с использованием программы Statistica 6.0. Все данные представлены в виде M±m. Значимость различий показателей между группами оценивали по тесту ANOVA и критерию Ньюмена—Кейлса для множественных сравнений (при p<0,05). Достоверность различий проницаемости парных мочевых пузырей оценивали по t-критерию Стьюдента для попарно связанных вариант.

Результаты и обсуждение

Влияние аналогов эксенатида на уровень гликемии в условиях нагрузки глюкозой. Изменение функции почек при сахарном диабете вызвано рядом причин, в том числе осмотическим диурезом, связанным либо с избыточным поступлением глюкозы при гломерулярной фильтрации в просвет проксимального канальца нефрона, либо с уменьшением ее реабсорбции. В исходном состоянии у крыс концентрация глюкозы в плазме составляет 6,2±0,3 ммоль/л. После внутрибрюшинного введения 0,3 мл на 100 г 50% раствора глюкозы ее концентрация в плазме почти удваивалась и постепенно к концу 1-го часа возвращалась к исходному значению (табл. 1).

В экспериментах с инъекцией 0,05 нмоль на 100 г эксенатида наблюдалась более быстрая нормализация уровня глюкозы в крови (см. табл. 1). Эксенатид и аналог II в этой дозе оказывали равное гипогликемическое действие. Аналог I был менее эффективен; он препятствовал повышению концентрации глюкозы в крови после ее внутрибрюшинного введения лишь в дозе 0,12 нмоль на 100 г (см. табл. 1).

Для сравнения стабильности синтезированных препаратов и эксенатида водные буферные растворы аналогов I и II инкубировали при 40 °С и pH 7,0 в течение 3 мес. Аликвоты растворов периодически отбирали и анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. За весь период исследования деградация пептидов не превышала 3%, тогда как деградация эксенатида составляла около 10% в течение 1 мес [11]. Таким образом, к достоинству новых синтезированных пептидов следует отнести их большую, чем у эксенатида, устойчивость в водных растворах при равной с эксенатидом гипогликемической активности на фоне нагрузки глюкозой.

Влияние аналогов эксенатида на функции почек. После инъекции крысам эксенатида или его аналогов в дозе 0,05 нмоль на 100 г возрастало мочеотделение. В течение первого получаса оно достигало максимума, затем постепенно снижалось до исходного уровня (рис. 1).

Рисунок 1. Влияние эксенатида и его аналогов на мочеотделение у крыс. Здесь и на рис. 1—3: стрелка — инъекция эксенатида или его аналогов в дозе 0,05 нмоль/100 г.
Сопоставление динамики влияния аналогов на мочеотделение показало, что аналог I обладает более выраженным эффектом, чем аналог II; вместе с тем оба аналога в меньшей степени повышали диурез, чем эксенатид. Одновременно с нарастанием мочеотделения после инъекции аналогов эксенатида отмечался выраженный рост экскреции ионов натрия (рис. 2).
Рисунок 2. Влияние эксенатида на выведение ионов натрия (UNaV), калия (UKV) и магния (UMgV) почкой крысы.
Экскреция калия возросла в меньшей степени. Отмечался заметный рост выведения ионов магния. В первые 30 мин после инъекции препаратов отмечается значительное увеличение образования и выделения осмотически свободной воды почкой (рис. 3).
Рисунок 3. Влияние эксенатида и его аналогов на очищение от осмотически свободной воды (СН2О) почкой крысы.
Через 45 мин экскреция осмотически свободной воды сменялась на ее интенсивную реабсорбцию. Общая экскреция осмотически свободной воды за 2 ч эксперимента после инъекции эксенатида или его аналогов достоверно снижалась (табл. 2).

Таким образом, эксенатид и аналоги I и II обладают высокой, ранее неизвестной селективной ионорегулирующей и диуретической активностью. Клинически важным является усиление экскреции жидкости и натрия почкой в сочетании со слабым влиянием на выделение калия из организма, поскольку это благоприятствует нормализации водно-солевого обмена и не вызывает неблагоприятных побочных эффектов, связанных с гипокалиемией.

Влияние вазопрессина и эксенатида на осмотическую проницаемость мочевого пузыря лягушки. Важно было выяснить, действует ли эксенатид на функции почек прямо или опосредованно физиологически активными веществами, выделяющимися в кровь под его влиянием (подобно тому, как это происходит в случае инсулина). Для ответа на этот вопрос были проведены опыты на эпителии кожи и мочевого пузыря лягушки. Мочевой пузырь амфибий является принятым тест-объектом при изучении регуляции проницаемости эпителия для воды и влияния вазопрессина. Существенно, что молекулярные механизмы увеличения реабсорбции воды в эпителии собирательных трубочек почки и мочевого пузыря лягушек практически сходны. В этих опытах эксенатид не влиял на осмотическую проницаемость ни сам по себе, ни при одновременном введении аргинин-вазопрессина (рис. 4).

Рисунок 4. Влияние эксенатида и аргинин-вазопрессина на транспорт воды в мочевом пузыре лягушки. Стрелки — момент добавления препаратов в раствор со стороны серозной оболочки. NS — p>0,05 при сравнении групп. Здесь и на рис. 5: АВП — аргинин-вазопрессин.
Полученные данные позволяют заключить, что эффект эксенатида на осмотическую проницаемость эпителия опосредован физиологически активными веществами, синтезируемыми под его влиянием.

Влияние вазопрессина и эксенатида на транспорт натрия в коже лягушки. Эпителий кожи лягушки служит тест-объектом при изучении действия гормонов и лекарственных средств на транспорт натрия в дистальных сегментах нефрона. Добавление 10-6 М эксенатида к раствору с внутренней стороны кожи, где располагаются кровеносные сосуды, не снижало значений тока короткого замыкания; напротив, наблюдалась тенденция к его увеличению (рис. 5).

Рисунок 5. Влияние эксенатида и аргинин-вазопрессина на ток короткого замыкания (ТКЗ) в коже лягушки. Стрелки — момент добавления препаратов в раствор со стороны внутренней поверхности кожи лягушки.
На фоне действия эксенатида сохраняется нормальная реакция клеток на аргинин-вазопрессин: увеличение транспорта натрия и эквивалентного ему тока короткого замыкания. Отсутствие прямого тормозящего влияния эксенатида на транспорт натрия в коже лягушки, по-видимому, свидетельствует об отсутствии у него собственного эффекта на транспорт натрия в эпителии дистальных отделов нефрона.

Таким образом, новые синтезированные аналоги эксенатида сопоставимы с эксенатидом по гликемическому эффекту, но обладают большей устойчивостью в растворе, что может придавать им определенные преимущества. В литературе практически нет данных об изменении деятельности почек под влиянием эксенатида. В нашей работе установлен ряд положительных (с клинической точки зрения) эффектов этих пептидов — диуретическое и натрийуретическое действие в сочетании с сохранением калия в организме. Особенно важно впервые обнаруженное нами влияние эксенатида на осморегулирующую функцию почек и выведение осмотически свободной воды, т.е. его способность стабилизировать осмотический гомеостаз.

В нашей работе показано, что влияние эксенатида на функции почек зависит от вовлечения неизвестных эндогенных, возможно, эндокринных факторов. Нормализация гликемии при участии ГПП-1 и эксенатида зависит от их способности усиливать секрецию инсулина в условиях повышенной концентрации глюкозы в крови. Исследования на эпителии кожи и мочевого пузыря, функционально подобных клеткам дистального сегмента нефрона, свидетельствуют о том, что в исходном состоянии и в присутствии аргинин-вазопрессина эксенатид не влияет на систему реабсорбции воды и натрия ex vivo. Следовательно, те эффекты, которые постоянно проявляются in vivo, могут быть опосредованы секрецией физиологически активных веществ, меняющих функцию почек. Таким образом, речь может идти не только о синтезе новых эффективных аналогов эксенатида, но и о новых сторонах его функциональной активности в эндокринной системе.

Выводы

1. Синтезированы аналоги эксенатида с заменой аминокислотных остатков в 14-м, 35-м, 39-м положениях.

2. Аналоги подобно эксенатиду оказывают гипогликемический эффект при гипергликемии.

3. Синтезированные аналоги эксенатида обладают большей устойчивостью в растворе.

4. Эксенатид и его аналоги усиливают выведение почкой натрия, магния и осмотически свободной воды в сочетании с сохранением ионов калия.

5. Эксенатид не оказывает прямого ингибирующего влияния на транспорт натрия и воды на изолированной коже и мочевых пузырях лягушки. Его действие in vivo, вероятно, опосредовано образованием физиологически активных веществ.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 08-04-00610), программ «Ведущие научные школы» (проект НШ-65100.2010.4) и ОБН РАН.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail