Введение

Внеклеточный матрикс (ВКМ) представляет собой структурную сеть, состоящую из разнообразных компонентов, представляющих многодоменные макромолекулы, которые работают бок о бок друг с другом и отвечают за формирование межклеточного каркаса и неклеточной структуры, в первую очередь обеспечивающей физическую и механическую стабильность ткани. Однако также ВКМ играет ключевую роль в основных активностях клеток, таких как пролиферация, дифференцировка, миграция, и даже отвечает за то, что является внеклеточной средой, которая содержит множество химических соединений, ферментов, факторов роста, хемокинов и цитокинов, которые являются необходимыми сигнальными молекулами для функционирования клеток [1, 2]. ВКМ отличается высокой динамичностью, поскольку он постоянно откладывается, ремоделируется и деградирует для поддержания гомеостаза тканей. ВКМ является основным структурным компонентом микроокружения как нормальных, так и опухолевых тканей, и его реорганизация напрямую зависит от процессов, происходящих в ткани [3]. Физическая и химическая гетерогенность ВКМ как на уровне различных органов, так и на уровне одного органа, но в различных его состояниях играет ключевую роль во всех биологических системах, что используется для детектирования в различных областях исследований, таких как разработка лекарств, в диагностике ряда заболеваний, в том числе онкологических, которые могут быть частью определения микроокружения рака и нацеливания на него [4]. Кроме того, важность гетерогенности ВКМ также можно отметить в исследованиях по разработке лекарственных средств, где было показано, что чувствительность к лекарственным средствам может различаться среди клеток одной клеточной популяции в зависимости от паттернов сигналов ВКМ, окружающих клетки [5, 6]. Формирование гетерогенности зависит от нескольких факторов, поскольку рассматривается как случайные результаты развития организма, в то время как эти факторы могут быть в основном классифицированы как генетические и негенетические факторы [7]. К негенетическим могут быть также отнесены внутренние факторы, вызванные модификациями, произошедшие с внеклеточным окружением, в частности с фибриллярными белками, и ассоциированные с возрастными изменениями [8]. Образование конечных продуктов гликирования (КПГ) — естественный процесс, который происходит во время старения, однако с большей скоростью он протекает при избытке глюкозы [9]. Помимо глюкозы в производство КПГ большой вклад также вносит пентоза, а пентозидин считается одним из основных соединений КПГ. Было показано, что коллаген является основной мишенью для пентозидина, поскольку он образует с ним поперечные связи. Сшивание коллагена посредством образования КПГ приводит к накоплению неправильно свернутого нефункционального коллагена, что в некоторых случаях приводит к уменьшению его длины, возникновению зон повышенной жесткости и является причиной повышенного хронического воспаления. Кроме того, сшивки КПГ способствуют апопотозу, инициируемому по пути AGEs-RAGE, что является причиной ухудшения состояния при ряде заболеваний [10]. Карбоксиметиллизин — это еще один тип КПГ, связанного со старением и хроническими заболеваниями. Он образуется в результате реакции между карбонильной группой восстанавливающего сахара или продукта окисления липидов и эпсилон-аминогруппой лизина в белках и является маркером повреждения клеток, окислительного стресса и воспаления.

Рамановская спектроскопия, или спектроскопия комбинационного рассеяния, — это неинвазивный безметочный метод, который основан на неупругом рассеянии отраженного света поляризованными молекулами и используется для измерения частот колебаний различных функциональных групп, что в конечном итоге предоставляет нам разнообразную информацию о химическом составе сканируемого образца. Более того, спектры комбинационного рассеяния света получаются особым способом, отличным от любой другой спектрометрии. Это зависит в основном от облучения образца-мишени интенсивным лазерным лучом одной частоты в виде монохроматического света, который называется падающим лучом [11]. Использование рамановской спектроскопии считается относительно новым методом изучения ВКМ, однако из-за отсутствия меток и неинвазивных свойств она приобретает все большую популярность у исследователей и врачей, позволяя получить большую спектральную информацию, что дает возможность проводить диагностику и выявлять различные патологии или проводить раннее скринирование. Так, например, данный метод описан для выявления возрастных заболеваний, в частности связанных с опорно-двигательной системой, таких как остеоартрит и артроз, а также для дифференциальной диагностики с остеосаркомой [12]. Рамановская спектроскопия использовалась в качестве диагностического инструмента для выявления признаков аневризмы грудной аорты [13], для картирования и молекулярной характеристики неопухолевых и раковых тканей [14, 15].

Однако, несмотря на исследования ВКМ, в том числе методами рамановской спектроскопии, данные все равно являются недостаточными и требуют разработки стандартизированных методов, позволяющих разработать подходы к оценке состояния ВКМ с учетом его органотипических и возрастных особенностей.

Материал и методы

Для исследования использовали органы (легкие, почки, мозг) джунгарских хомячков молодого возраста (около 2 мес) и пожилого возраста (около 2 лет). Животные подвергались эвтаназии в соответствии с принципами 3R. Полученные органы замораживались, после чего из них получали криосрезы толщиной 15 мкм с помощью криотома (криостат Thermo Scientific Cryotome FSE Cryostat Microtome A78900104). До момента использования криосрезы хранились при температуре –20 °C на флюоритовом стекле, подходящем для рамановской спектроскопии. Микроскопические изображения были получены с помощью световой и конфокальной микроскопии матриксов тканей легких, мозга и почек старых и молодых хомячков с объективом ×100. Измерения безметочной спектроскопии комбинационного рассеяния проводились с помощью конфокального микроскопа с рамановской установкой Confotec NR500 (SOL Instruments Ltd.), при этом использовался лазер с длиной волны 532 нм и выходной мощностью 30 мВт. Для фокусировки возбуждающего света и сбора рамановского сигнала использовались объективы с увеличением ×100. Каждый спектр измеряли с шагом 10 мкм, спектры регистрировались с временем накопления сигнала 2 с, область интереса определялась в диапазоне 600—1800 см^–¹ для охвата наиболее значимого биологического профиля, срезы были покрыты раствором фосфатно-солевого буфера во избежание пересыхания во время измерения. Для предварительной обработки полученных спектров использовалось программное обеспечение OriginLab 2018. Для сглаживания всех спектров использовался фильтр Савицкого—Голея (четвертого порядка, 20 точек). Коррекция базовой линии проводилась методом асимметричного сглаживания наименьших квадратов. Нормализация рамановских спектров проводилась в диапазоне (0,1). Мы проводили сравнение спектров из срезов в пределах каждого органа, для этого из каждого образца среза брали 10 спектров максимальной интенсивности против 10 спектров минимальной интенсивности, проводили их сглаживание, вычитание базовой линии, нормализацию, усреднение по каждому 10, нахождение нормализованных значений каждого пика в 10 спектрах для высокой и в 10 спектрах для низкой интенсивности, двухвыборочный t-критерий Стьюдента. После этого проводили сравнение старых и молодых тканей одного органа путем выбора пиков, связанных с продуктами КПГ: пентозидином, карбоксиметиллизином, а также коллагеном I типа.

Статистический анализ. Для статистического сравнения значимости различий в интенсивности комбинационного рассеяния между трех типов тканей был применен двухвыборочный t-критерий Стьюдента к пикам комбинационного рассеяния. Все пики групп сравнения были подвергнуты тесту Левена для проверки равенства дисперсий двух групп; в случае если значение p теста Левена было больше 0,05, использовали t-критерий Уэлча.

Результаты

В результате оценки содержания матриксассоциированных продуктов старения в ткани молодых и старых легких отмечалось значительное увеличение интенсивности большинства пиков пентозидина (1480, 1064, 1048, 840 см^–1) и карбоксиметиллизина (926, 852 см^–1) от молодой к старой легочной ткани, в то время как для коллагена I типа были показаны лишь незначительное изменение интенсивности пиков. Для легких наиболее значимые различия достигались на следующих пиках, характерных для пентозидина: на 1480 см^–1 значение относительной интенсивности старой ткани легких составляла 0,77979±0,17704 относительной единицы (о.е.) против 0,54461±0,05122 о.е. в ткани молодых легких (P=0,00216), на 1064 см^–1 значения относительной интенсивности составляли 0,35796±0,18122 о.е. в старых против 0,15152±0,06022 о.е. в молодых легких (P=0,00576), на 1048 см^–1 значения относительной интенсивности составляли 0,2538±0,13253 о.е. в старых против 0,10305±0,06569 о.е. в молодых легких (P=0,00657), на 840 см^–1 — 0,35639±0,12217 о.е. в старых против 0,20675±0,12217 о.е. в молодых легких (P=0,00482). Для карбоксиметиллизина наиболее значимые различия достигались на следующих характерных пиках: на 926 см^–1 значения относительной интенсивности составляли 0,23145±0,13342 о.е. в старых против 0,08389±0,02894 о.е. в молодых легких (P=0,00496), на 852 см^–1 значения относительной интенсивности составляли 0,3237±0,16811 о.е. в старых против 0,08842±0,03633 о.е. в молодых легких (P=0,00156). Для коллагена I типа небольшие изменения наблюдались на следующих характерных пиках: на 854 см^–1 значения относительной интенсивности составляли 0,27356±0,09818 о.е. в старых против 0,18985±0,06338 о.е. в молодых легких (P=0,03833), на 765 см^–1 значения относительной интенсивности составляли 0,28799±0,09426 о.е. в старых против 0,37568±0,0458 о.е. в молодых легких (P=0,02013).

Для мозга значимых различий между образцами ткани от молодых и старых особей для пиков пентозидина не наблюдалось. Мы зафиксировали увеличение интенсивности от молодой к старой ткани мозга для карбоксиметиллизина на 1460 см^–1 и для коллагена I типа на 1319, 1213, 1003, 854 см^–1.

Мы наблюдали следующие изменения пиков, характерных для карбоксиметиллизина: на 1460 см^–1 значения относительной интенсивности составляли 0,90055±0,07971 о.е. в ткани старого мозга против 0,65711±0,06743 о.е. в молодом мозге (P=0,09211). Для пика. на 1360 см^–1 значения относительной интенсивности составляли 0,14872±0,04218 о.е. в ткани старого мозга против 0,30224±0,11566 о.е. в молодом мозге (P=0,00217). Менее значимые изменения регистрировались на 1156 см^–1: значения относительной интенсивности составляли 0,19835±0,06596 о.е. в ткани старого мозга против 0,31581±0,11725 о.е. в молодом мозге (P=0,01516), на 1078 см^–1 значения относительной интенсивности составляли 0,08901±0,01718 о.е. в ткани старого мозга против 0,15027±0,07141 о.е. в молодом мозге (P=0,02476), на 926 см^–1 значения относительной интенсивности составляли 0,1358±0,02837 о.е. в ткани старого мозга против 0,21145±0,07777 о.е. в молодом мозге (P=0,01428), на 852 см^–1 значения относительной интенсивности составляли 0,15129±0,02753 о.е. в ткани старого мозга против 0,22051±0,08041 о.е. в молодом мозге (P=0,02566). Значимые различия наблюдались на следующих пиках, характерных для коллагена I типа: на 1319 см^–1 значения относительной интенсивности составляли 0,30843±0,0499 о.е. в ткани старого мозга против 0,19238±0,09873 о.е. в молодом мозге, (P=0,0054), для 1243 см^–1 значения относительной интенсивности составляли 0,08323±0,05312 о.е. в ткани старого мозга против 0,19414±0,08564 о.е. в молодом мозге (P=0,00335), для 1003 см^–1 значения относительной интенсивности составляли 0,1223±0,05412 о.е. в ткани старого мозга против 0,24061±0,09062 о.е. в молодом мозге (P=0,00303), для 854 см^–1 значения относительной интенсивности составляли 0,1368±0,03491 о.е. в ткани старого мозга против 0,22618±0,06616 о.е. в молодом мозге (P=0,00212).

Для почек значимых различий между образцами ткани от молодых и старых особей для пиков пентозидина также не наблюдалось. Было зафиксировано увеличение интенсивности от молодой к старой ткани почек для карбоксиметиллизина на 1156 см^–1 и для коллагена I типа на 1453 см^–1.

Для почек значимых различий между образцами от молодых и старых особей для пиков пентозидина не наблюдалось, для карбоксиметиллизина изменения регистрировались на 1156 см^–1, значения относительной интенсивности составляли 0,23892±0,10169 о.е. в ткани старых почек против 0,09205±0,03053 о.е. в молодых почках (P=0,00121), для коллагена I типа наблюдались небольшие изменения: на 1453 см^–1 значения относительной интенсивности составляли 0,72399±0,16201 о.е. в ткани старых почек против 0,53853±0,14383 о.е. в молодых почках (P=0,01456), на 938 см^–1 значения относительной интенсивности составляли 0,10647±0,05227 о.е. в ткани старых почек против 0,16744±0,05029 о.е. в молодых почках (P=0,01602).

Обсуждение и заключение

Сравнительная оценка рамановских спектров старых и молодых тканей различных органов выявила гетерогенность в изменении основных матриксассоциированных маркеров, что говорит в первую очередь о неравномерном повреждении тканей организма и наличии определенных характерных особенностей и доминант панели маркеров ВКМ, связанных с протеканием процессов тканевого ремоделирования, оксидативного стресса, накопления продуктов гликирования, апопотоза клеток. Наличие тех или иных значимых изменений в значениях пиков рамановских спектров позволяет выявлять превалирующий процесс в ткани. Так, например, мы показали, что в старых легких идет активный процесс накопления КПГ, в то же время в ткани мозга и почек значимых изменений КПГ, связанных с возрастом, мы не обнаружили. В то же время в ткани стареющего мозга определялись признаки ремоделирования ткани за счет увеличения интенсивности пиков коллагена I типа, что может быть связано как с репаративными процессами за счет увеличения синтеза или накопления коллагена I типа, так и с процессами деградации остальных компонентов ткани, за счет чего процентное соотношение и представленность коллагена I типа типа возросли. Данное исследование подтверждает эффективность рамановской спектроскопии как инструмента для идентификации и характеристики матриксассоциированных маркеров, который имеет хорошую перспективу применения в фундаментальных и прикладных исследованиях, включая диагностику и разработку лекарств, создание тест-систем, включающих персонализированные матриксы и ткани, в том числе опухоль-ассоциированные.

Финансирование. Это исследование финансировалось Министерством науки и высшего образования Российской Федерации (Госзадание), проект №FSMG-2024-0049.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.