Оценка эффективности соединений N-ацетил-6-аминогексановой кислоты при местном лечении экспериментального периодонтита

Периодонтит — хроническое инфекционное заболевание полости рта, возникающее в результате нарушения регуляции иммунного ответа хозяина на микроорганизмы в биопленке зубов [1, 2]. Развитие воспалительной реакции включает активацию различных внутриклеточных процессов, метаболической регуляции клеточных и тканевых функций, включая избыточную продукцию провоспалительных цитокинов — фактора некроза опухолей (ФНО) и интерлейкина-1 (ИЛ-1). Это способствует увеличению выживаемости нейтрофилов [3] и характеру дифференцировки остеокластов [4]. Резорбция периодонтальной кости в процессе развития периодонтита индуцируется остеокластами. Рецептор — активатор лиганда ядерного фактора-κB, его рецептор RANK и рецептор остеопротегерина (OPG) являются ключевыми молекулами, которые регулируют дифференцировку, рекрутирование и функцию остеокластов [5].

В проведенных ранее исследованиях показано, что N-ацетил-6-аминогексановая кислота и некоторые ее производные способны замедлять формирование воспалительного ответа на повреждение тканей, в том числе инфекционной природы, оказывая антиоксидантное и цитопротекторное действие [5]. Отечественными учеными из АО «ВНЦ БАВ» синтезированы новые соединения N-ацетил-6-аминогексановой кислоты с диметилацетамидом (ЛХТ-9-17) и 3-гидроксипиридином (ЛХТ-6-17), для которых при внеэкспериментальном прогнозировании авторами получены высокие коэффициенты противовоспалительной активности [6, 7]. Кроме того, созданы удобные топические формы соединений — 2% гель.

Цель исследования — изучение влияния топического применения соединения N-ацетил-6-аминогексановой кислоты на выраженность воспалительной реакции и структуру костной ткани зуба и челюсти при экспериментальном периодонтите у крыс.

Исследование выполнено в строгом соответствии с требованиями гуманного обращения с лабораторными животными. Протокол исследования рассмотрен и одобрен на заседании локального этического комитета ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарева».

В работе исследованы два соединения N-ацетил-6-аминогексановой кислоты — 3-гидроксипиридина N-ацетил-6-аминогексаноат (соединение ЛХТ-6-17) и диметилфенилацетамида N-ацетил-6-аминогексаноат (ЛХТ-9-17) в виде 2% гелей, произведенных АО «ВНЦ БАВ» (Старая Купавна Московской области). В качестве препаратов сравнения использовали гель гиалуроновой кислоты.

Эксперименты поставлены на 20 белых лабораторных крысах-самцах линии Wistar массой 200—220 г, приобретенных в филиале «Электрогорский» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА» России. Животные содержались в экспериментально-биологической клинике (учебном виварии) медицинского института ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарева» и виварии Центра биомедицинских технологий ФГАОУ «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет) и были разделены на 4 группы по 5 животных в каждой: контроль, группа препарата сравнения (гель гиалуроновой кислоты, HAG), группа ЛХТ-6-17 и группа ЛХТ-9-17, а «интактную» — 5-ю — группу составили экспериментальные животные с исследуемой контралатеральной половиной верхней челюсти.

Для воспроизведения экспериментального повреждения тканей периодонта использовали модель лигатурного периодонтита второго верхнего моляра [8], для чего голову наркотизированного уретаном (800 мг/кг внутрибрюшинно) животного фиксировали в стереотаксической установке в положении ретрофлексии. На шейку второго верхнего моляра справа накладывали нейлоновую стерильную лигатуру 3-0 (Ethicon, США), предварительно обнажив ее от прилегающей десны. Контралатеральная половина верхней челюсти оставалась интактной. Животных контрольной группы оставляли без лечения. В течение 10 сут наблюдения, начиная со 2-х суток после моделирования патологии, ежесуточно в зубодесневой карман закладывали 0,1 г геля гиалуроновой кислоты (группа препарата сравнения), 2% геля, содержащего 3-гидроксипиридина N-ацетил-6-аминогексаноат (группа ЛХТ-6-17) или диметилфенилацетамида N-ацетил-6-аминогексаноат (группа ЛХТ-9-17). На 12-е сутки от начала эксперимента животных повторно наркотизировали, выполняли компьютерную микротомографию, после чего выводили из эксперимента, биологический материал области интереса забирали.

Верхнюю челюсть крыс сканировали на аппарате микроКТ SkyScan (модель 1172, Kontich, Бельгия). Файлы компьютерной микротомографии (микроКТ) импортировали в пакет программного обеспечения Dolphin® (Dolphin Imaging, США) для анализа линейной потери костной массы, которую рассчитывали в миллиметрах между цементно-эмалевым соединением пораженного патологическим процессом зуба и гребнем альвеолярного отростка верхней челюсти. Соотношения объема кости и общего объема ткани (BV/TV) рассчитывали с использованием пакета программного обеспечения DataViewer (версия 1.5.2; Bruker, США) для трехмерного анализа.

Светооптическим методом исследовали окрашенные гематоксилином и эозином срезы верхней челюсти и тканей десны в неповрежденных областях и в области воспроизведения экспериментальной патологии у лабораторных крыс на фоне местной десятисуточной аппликации гелей, содержащих изучаемые соединения. При патоморфологическом описании образцов верхней челюсти оценивали инфильтрацию тканей воспалительными клетками (нейтрофилы, макрофаги), а также целостность альвеолярной кости и цемента с помощью специальной патоморфологической шкалы [8]: 0 — отсутствие или незначительная воспалительная инфильтрация тканей, ограниченная маргинальной десной, с сохранением альвеолярного отростка и цемента; 1 — умеренная воспалительная клеточная инфильтрация всей десневой пластинки с незначительной альвеолярной резорбцией и интактным цементом; 2 — выраженная воспалительно-клеточная инфильтрация десны и периодонтальной связки с выраженной деградацией альвеолярного отростка и частичным разрушением цемента; 3 — выраженная воспалительная клеточная инфильтрация с полной резорбцией альвеолярного отростка и выраженным разрушением цемента.

Уровни ИЛ-1β и α-ФНО определяли методом количественного ИФА с использованием коммерческих наборов Cusabio Biotech (Китай) согласно инструкциям производителя.

Достоверность различий между средними величинами вычисляли с помощью ANOVA с применением вторичного (post-hoc) теста Тьюки или теста Манна—Уитни при 5% уровне значимости [9]. Анализ данных выполняли в программной среде STATA 17.3 (США).

По данным микроКТ верхних челюстей лабораторных крыс с экспериментальным периодонтитом в интактной группе (контралатеральная сторона верхней челюсти), среднее значение показателя (M±SD) составляло 0,47±0,04 мм. У животных с сформированным экспериментальным периодонтитом (контрольная группа) расстояние между цементно-эмалевым соединением пораженного патологическим процессом зуба и гребнем альвеолярного отростка верхней челюсти в среднем составило 1,48±0,07 мм (p=0,005 при сравнении с интактной группой; рис. 1, а).

Рис. 1. Влияние топических соединений N-ацетил-6-аминогексановой кислоты на костную массу верхней челюсти у крыс с периодонтитом.

а — линейная потеря костной ткани; б — соотношение объема костной массы и общего веса тканей (BV/TV) в исследованных фрагментах верхней челюсти: HAG — гель гиалуроновой кислоты; n=5 в каждой группе; M±SD.

Местное применение геля гиалуроновой кислоты сопровождалось сокращением линейной потери костной массы в среднем до 1,29±0,05 мм (p=0,005 при сравнении с контрольной группой животных), однако показатель не достигал значений интактных участков верхней челюсти лабораторных животных (см. рис. 1, а). Топическая аппликация соединения N-ацетил-6-аминогексановой кислоты в зубодесневой карман в течение 10 сут приводила к статистически значимому сокращению линейной потери костной массы, отличающейся также от группы животных, получавших в качестве лечения гель гиалуроновой кислоты. Так, в частности, в группе животных, которым вводили гель ЛХТ-9-17, показатель составил 0,87±0,05 мм (p=0,005 при сравнении с контрольной группой животных, p=0,02 при сравнении животных с применением геля гиалуроновой кислоты, с интактными фрагментами челюсти), а в группе крыс, получавших ЛХТ-6-17 — 0,65±0,04 мм (p=0,001 при сравнении с контрольной группой животных, p=0,03 при сравнении с гелем гиалуроновой кислоты, с интактными фрагментами челюсти).

Кроме того, после трехмерной реконструкции и расчета показателя BV/TV у лабораторных животных мы установили, что в интактной группе среднее значение показателя составляло 84,3±3,1%. У животных с периодонтитом отношение вес костной массы/общий вес тканей верхней челюсти в области второго моляра в среднем составило 3,2±1,2% (p=0,0001 при сравнении с интактной группой; рис. 1, б). Местное применение геля диметилацетамида N-ацетил-6-аминогексаноата (ЛХТ-9-17) сопровождалось ростом BV/TV до 23,9±4,3% (p=0,005 при сравнении с контрольной группой животных). В группе животных, которые получали топическое воздействие гелем, содержащим в качестве действующего вещества 3-гидроксипиридина N-ацетил-6-аминогексаноат (ЛХТ-6-17), волюметрический показатель составил в среднем 36,2±3,3 мм (p=0,0001 при сравнении с контрольной группой животных, p=0,005 при сравнении с животными, получавшими гель гиалуроновой кислоты).

Гистопатологический анализ показал, что в интактных областях полости рта экспериментальных животных структуры ткани пародонта — маргинальной десны и связок, а также периодонта и альвеолярной кости сохранились в неизменном виде на протяжении всего опыта. Значение гистопатологической шкалы тяжести воспалительной реакции составило 0—0 (рис. 2), что соответствовало нормальному состоянию тканей.

Рис. 2. Гистопатологическая шкала тяжести поражения тканей пародонта в баллах; M±SD: p<0,05 * — при сравнении с интактными областями, ** — с контролем, *** — с ЛХТ-9-17.

Экспериментальный периодонтит сопровождался инфильтрацией мягких тканей воспалительными клетками в сочетании с разрушением цемента пораженного патологическим процессом второго моляра и альвеолярного отростка верхней челюсти. Средняя гистопатологическая оценка для этой экспериментальной группы составила 4 балла (диапазон 4—4 балла; p<0,05 при сравнении с интактными контралатеральными областями; см. рис. 2). В группе животных, получавших гель ЛХТ-6-17, регистрировали клеточную инфильтрацию легкой степени выраженности, ограниченную областью десны, с сохраненной альвеолярной костью и цементом. Средняя гистопатологическая оценка в этой группе составила 1 балл (диапазон 1—1 балл; p<0,001 при сравнении с интактными областями и контрольными животными; см. рис. 2). На фоне местного воздействия гелем диметилацетамида N-ацетил-6-аминогексаноата (ЛХТ-9-17) средняя гистопатологическая оценка был равна 2,5 балла (диапазон 2—3 балла; p<0,05 при сравнении с интактными областями; см. рис. 2).

В ткани пародонта интактного второго верхнего моляра концентрация ИЛ-βсоставляла в среднем 200±21 пг/мл, α-ФНО — 256±32 пг/мл (рис. 3).

Рис. 3. Влияние топического применения геля, содержащего соединение N-ацетил-6-аминогексановой кислоты ЛХТ-6-17, на концентрацию интерлейкина-1-бета (IL-1β; а) и α-фактора некроза опухолей (TNFa; б) в ткани пародонта; M±SD.

В условиях патологического процесса в контрольных наблюдениях при экспериментальном лигатурном периодонтите у лабораторных крыс наблюдается рост экспрессии обоих провоспалительных цитокинов в области дентина второго моляра (см. рис. 3): количественный показатель составил для ИЛ-1β в среднем 421±33 пг/мл (p=0,001 при сравнении с животными с интактными областями верхней челюсти), для α-ФНО — 3154±83 пг/мл (p=0,001 при сравнении с животными с интактными областями верхней челюсти). Местное ежедневное применение при экспериментальном лигатурном периодонтите 3-гидроксипиридина N-ацетил-6-аминогексаноата (ЛХТ-6-17) в виде геля в течение 10 сут сопровождается снижением концентрации обоих провоспалительных цитокинов в области второго моляра (см. рис. 3). Количественный показатель составил для ИЛ-1β в среднем 246±17 пг/мл (p=0,03 при сравнении с интактными областями верхней челюсти; p=0,005 при сравнении с контрольными областями верхней челюсти), для α-ФНО — 1976±77 пг/мл (p=0,001 при сравнении с интактными областями верхней челюсти и контролем).

Одним из перспективных направлений совершенствования лечения периодонтита является применение топических лекарственных средств, проявляющих противовоспалительные и цитопротекторные свойства. К таким веществам относятся соединения N-ацетил-6-аминогексановой кислоты, продемонстрировавшие высокую эффективность при раневом и воспалительном процессе по данным доклинических исследований [6, 7].

Мы установили, что на модели экспериментального лигатурного пародонтита верхнего второго моляра у лабораторных крыс 10-суточная местная аппликация геля, содержащего соединения N-ацетил-6-аминогексановой кислоты в качестве действующего вещества, приводит к предотвращению резорбции костной ткани как по линейному, так и по волюметрическому показателю, при этом наибольшей активностью обладает вещество 3-гидроксипиридина N-ацетил-6-аминогексаноат (ЛХТ-6-17). Вместе с тем ни одно из изученных соединений не способно сохранять массу костной ткани при патологическом процессе на уровне неповрежденных фрагментов верхней челюсти, что требует дальнейших исследований и может быть обусловлено отсутствием или слабым собственным противомикробным действием солей N-ацетил-6-аминогексановой кислоты. В целом топическое применение 3-гидроксипиридина N-ацетил-6-аминогексаноат (ЛХТ-6-17) в форме 2% геля можно рассматривать как перспективную терапевтическую опцию для лечения периодонтита.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Ю.Л. Васильев

Сбор и обработка материала — Е.В. Блинова, Я.А. Мазов, А.А. Дмитриев, К.Д. Блинов, Е.В. Елисейкина, Д.С. Блинов, А.Д. Глебочкина, Д.Е. Тимошкин, Р.М. Термулаева, Е.В. Семелева

Написание текста — Е.В. Блинова, Д.С. Блинов, А.Д. Глебочкина, Д.Е. Тимошкин, Р.М. Термулаева, Е.В. Семелева

Редактирование — Ю.Л. Васильев

Participation of authors:

Concept and design of the study — Yu.L. Vasil’ev

Data collection and processing — E.V. Blinova, Ya.A. Mazov, A.A. Dmitriev, K.D. Blinov, E.V. Eliseikina, D.S. Blinov, A.D. Glebochkina, R.M. Termulaeva, D.E. Timoshkin, E.V. Semeleva

Text writing — E.V. Blinova, D.S. Blinov, E.V. Semeleva, A.D. Glebochkina, R.M. Termulaeva, D.E. Timoshkin

Editing — Yu.L. Vasil’ev

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.