В настоящее время диагностика и лечение карцином молочной железы невозможны без определения гормонального рецепторного статуса, рецепторов HER2, а также индекса пролиферативной активности (ИПА) Ki-67, которые составляют диагностическую иммуногистохимическую панель IHC-4. Суррогатные молекулярные подтипы карцином молочной железы, выделенные на основании панели IHC-4, в которую включены иммуногистохимическое определение рецепторов Er, Pr, HER2 и оценка пролиферативной активности на основании антигена Ki-67. Они соотносятся с подтипами люминальным А, люминальным В, Basal-like и HER2 enriched [1].

Люминальный А-подтип считается наиболее часто встречающимся среди карцином молочной железы [1—3] и составляет до 60% от всех выявляемых случаев опухолей молочной железы. Он характеризуется рецепторным статусом ER+ и/или PR+/HER2–. Люминальный В-подтип составляет примерно 15% от всех карцином молочной железы [2, 3] и отличается рецепторным статусом ER+ и PR/HER2– или PR/HER2+.

Различие люминального, А от люминального В/HER2-подтипа карцином молочной железы важно для выбора вида лечения, так как последний требует назначения химио- и гормонотерапии с учетом клинических данных. Для различия этих подтипов между собой в 2011 г. панель экспертов Saint Gallen Consensus Meeting рекомендовала придерживаться границы уровня ИПА Ki-67 менее 14% для люминального А-подтипа и более 14% для люминального В-подтипа [4]. Очередной пересмотр границы произошел в 2013 г., когда было установлено значение 20% и более ИПА Ki-67 для люминального В-подтипа. Однако до сих пор граница ИПА между люминальными подтипами остается дискуссионной. В ряде работ продемонстрирован низкий уровень воспроизводимости ИПА Ki-67, особенно в диапазоне от 15 до 30% ИПА Ki-67 [5]. На очередной встрече панели экспертов в Saint Gallen Consensus Meeting в 2015 г. предложено использовать внутрилабораторное значение медианы ИПА Ki-67 в каждой отдельной лаборатории в качестве главного критерия воспроизводимости [6].

Одним из путей повышения воспроизводимости и объективизации при оценке люминальных подтипов является проведение цифрового анализа изображений (ЦАИ) при подсчете индекса Ki-67. Под ЦАИ понимают оценку качественных и количественных морфологических, иммуногистохимических, флюоресцентных характеристик оцифрованной копии гистологического препарата с помощью специального программного обеспечения [7—11]. Именно количественный подход к оцифрованной копии гистологического препарата рассматривается как одно из решений для повышения воспроизводимости количественных параметров в патоморфологии [12].

Отсутствие стандартизации оценки ИПА приводит к появлению доли случаев, которые имеют расхождение в зависимости от выбранной границы ИПА Ki-67 [13], что требует дополнительных методов анализа. Для оценки доли случаев, имеющих расхождение в распределении люминальных подтипов, А и В, проанализировали показатели ИПА Ki-67 в 64 случаях ER+ и HER2-инвазивных карцином молочной железы G2—3. ИПА Ki-67 был оценен визуально и с помощью цифрового анализа изображений с границей 14 или 20% ИПА Ki-67.

Цель исследования — показать, как различные подходы к оценке ИПА Ki-67 у экспертов, а также при цифровом анализе изображений гистологических препаратов влияют на распределение в классификации люминальных подтипов карцином молочной железы.

Из 104 случаев инвазивных карцином молочной железы, исследованных в лаборатории морфологии опухолей НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова в период с июля по октябрь 2016 г., отобрано 64 случая инвазивных неспецифицированных карцином молочной железы G2—G3 с рецепторным статусом ER+ и HER2–. Фиксированный в формалине (24 ч), залитый в парафин материал резецированных карцином подвергался стандартному морфологическому исследованию с оценкой степени гистологической злокачественности. Иммуногистохимическое исследование пролиферативной активности Ki-67 (клон MIB-1, «Dako») проведено согласно протоколу (табл. 1)

Полученные препараты оценены визуально. Первая оценка получена ретроспективно на основании данных, которые предоставляются в клинику в патоморфологическом заключении, а вторая оценка выполнена исследователем-патоморфологом независимо от ретроспективных данных. Методика визуальной оценки включала анализ не менее 3 полей зрения при увеличении в 40 раз с определением ИПА Ki-67 в зонах hot-spot и инвазивном крае опухоли. Затем препараты отсканировали с помощью сканера гистологических препаратов Panoramic III (Венгрия, 3D Histech) и получили цифровые изображения. ЦАИ провели с помощью программного обеспечения 3D Histech Quant Center (Венгрия, 3D Histech) c разметкой 3—10 аннотаций (рис. 1)

Статистический анализ выполняли с помощью программного обеспечения R-studio с применением непараметрического критерия Манна—Уитни.

В 8 (13%) случаях исследователями выявлено гетерогенное окрашивание с наличием зон hot-spot ИПА Ki-67. На рис. 2 показано

Медиана ИПА по анализируемому материалу, согласно данным автоматического модуля анализа Q, составила 13% (см. рис. 2).

Медианы распределения ИПА Ki-67 по способам оценки: QС 13%, ретроспективные данные 25%, исследователь 15%.

Данные, полученные при сравнении процентного распределения доли люминальных подтипов, А и В при использовании разных методических подходов и пороговых значений относительно границ индекса Ki-67, представлены в табл. 2.

Доля подтипа, А люминальных карцином в случае оценки с помощью модулей цифрового анализа CellQuant при пороговых значениях 14 и 20% составила 50,8% против 57% соответственно, т. е. при снижении пороговых показателей доля люминального подтипа, А снижается приблизительно на 7%.

При сравнении показателей индекса Ki-67 в этих же случаях по данным ответов в клинику (ретроспективные данные без пересмотра) доля люминального А-подтипа карцином составила всего 25% при использовании порогового значения в 14%, т. е. имеется почти двукратное снижение числа люминального А-подтипа при низком пороге ИПА Ki-67 по сравнению с ЦАИ. Однако при повышении порога до 20% доля люминального А-подтипа возрастает до 48% и приближается к данным, полученным в ходе ЦАИ (57%).

В качестве контроля визуального метода оценки все препараты оценены независимым исследователем. Доля люминального А-подтипа при индивидуальной визуальной оценке уровня Ki-67 с пороговым значением 14% составила 43%, а при повышении порога до 20% — 63%. Таким образом, при увеличении порогового уровня Ki-67 наблюдали более равномерное распределение доли люминального А-подтипа. Это составляет, по ретроспективным данным, 48%, ЦАИ 57% и исследовательской визуальной оценке 63% ИПА Ki-67.

Медиана ИПА Ki-67, полученная в исследовании среди люминального А- и люминального В-подтипов, показала значения, соотносящиеся с данными литературы относительно применения ЦАИ и визуальной оценки [14]. Полученные результаты указывают на расхождение оценки ИПА и неравномерное распределение пациентов в группах люминальных подтипов в зависимости от метода оценки. Такая тенденция прослеживается и в работе ряда других исследователей [15—20], где распределение на подтипы показывает разброс от 35 до 70% для люминального А-подтипа при использовании границы в 14 и 20% ИПА Ki-67 соответственно. Это имеет важное клиническое значение для дальнейшего применения химиотерапии в случае попадания пациентки в группу люминального В-подтипа, учитывая тот факт, что рекомендованные границы лежат в пределах недостаточно воспроизводимого ИПА Ki-67 10—30%. Различия распределения ИПА Ki-67 в зависимости от метода анализа накладывают большую ответственность на онколога и патоморфолога для корректного анализа материала. Увеличение количества случаев люминального В-подтипа карцином молочной железы при анализе ретроспективных данных относительно результатов независимого исследователя или ЦАИ показывает, что одни и те же пациенты могут получить разную терапию в зависимости от заключения патоморфологов лечебных учреждений. Использование показателя ИПА Ki-67 для определения тактики лечения остается предметом дискуссий. Одна из авторитетных организаций США по созданию руководств для лечения и диагностики опухолей American National Comprehensive Cancer Network (NCCN) не предоставляет информации об использовании ИПА Ki-67 при лечении карцином молочной железы ввиду низкой воспроизводимости этого показателя [21]. Предлагаем рассмотреть возможность применения цифровой патологии в качестве критерия воспроизводимости между исследователями в целях гармонизации подхода к определению ИПА Ki-67 [22]. Предметом дискуссии остаются вопросы подсчета ИПА в целом препарате или только в зонах hot-spot в случае наличия гетерогенности окрашивания. Недавние исследования [23, 24] показали, что разница между подсчетом в случае гетерогенности окрашивания Ki-67 карцином молочной железы в зонах hot-spot не будет оказывать прогностическое влияние на выживаемость, но как от этого изменится тактика применяемой химиотерапии, остается вопросом. Мы придерживаемся точки зрения, что исследователи, работающие с оценкой ИПА Ki-67, должны пройти курс обучения для гармонизации этого показателя с применением технологий цифрового анализа изображений.

При ЦАИ количество случаев люминального подтипа, А было на 25% больше по сравнению с визуальной оценкой при использовании границы 14% ИПА Ki-67. Граница в 20% ИПА Ki-67 показала равномерное распределение случаев между исследователями и ЦАИ. Необходим стандартизованный подход к оценке ИПА Ki-67 с целью назначения адекватной терапии при люминальных подтипах карцином молочной железы в условиях использования панели IHC-4.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — В.А.К., А.Г.К.

Сбор и обработка материала — В.А.К., Е.С.А.

Статистическая обработка — В.А.К.

Написание текста — В.А.К., А.Г.К.

Редактирование — А.Г.К., В.А.К.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Кушнарев Владимир Андреевич — https://orcid.org/0000-0003-4608-9349; e-mail: kushnarevvladimir1@gmail.com

Артемьева Е.С. — e-mail: eskate-379@mail.ru

Кудайбергенова А.Г. — https://orcid.org/0000-0001-7797-088X; e-mail: asel1972@mail.ru

Автор, ответственный за переписку: Кушнарев Владимир Андреевич — e-mail: kushnarevvladimir1@gmail.com