Опухоли традиционно рассматриваются как заболевания, в основе которых лежит нарушение генетического аппарата. Однако в последнее время все более очевидным становится то, что в процессе канцерогенеза важную роль также играют эпигенетические изменения [1]. К эпигенетическим изменениям относят все нарушения, которые не связаны с изменениями структуры ДНК, но приводят к изменениям уровня экспрессии генов. Эти изменения включают метилирование регуляторных районов генов (промоторов), изменения в структуре хроматина, РНК-интерференцию, варианты альтернативного сплайсинга [2].

Наиболее изученным из этих изменений в контексте онкологических заболеваний является гиперметилирование промоторов генов-супрессоров опухолевого роста. Нарушения метилирования являются ключевым механизмом увеличения или уменьшения экспрессии генов при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ). Многочисленными исследованиями было показано аберрантное метилирование генов, участвующих в основных морфогенетических клеточных процессах, таких как регуляция клеточного цикла, пролиферация, апоптоз, адгезия, подвижность и репарация ДНК. Примерами генов, метилирование которых характерно для НМРЛ, являются p16, RASSF1A, APC, RARb-2, CDH1, CDH13, DAPK, MGMT, ASC/TMS1, FHIT, hSRBC, TSLC1, DAL-1 и PTEN [3—6]. В работе исследователей из Китая по анализу эпигенетических нарушений в НМРЛ было выявлено гиперметилирование промоторов генов CALCA, CDH1, DAPK1, IRX2, TIMP3, PAX6. Изменения в каждом из этих генов были ассоциированы с такими клинико-морфологическими параметрами, как гистологический тип опухоли, стадия заболевания, наличие метастазов, инвазивный рост опухоли и курение [7]. В другой работе [8] проводился сравнительный анализ частоты эпигенетических изменений панели генов: APC, CDH1, MGMT, DCC, RASSF1A, AIM в сыворотке крови у пациентов НМРЛ и контрольной группе здоровых (без онкологии) доноров. Метилирование промотора хотя бы одного из 6 генов в панели выявлено в 84% случаев НМРЛ. Ген DCC имел 100% чувствительность для НМРЛ [8]. Описанные данные показывают большие перспективы для оценки эпигенетических нарушений в НМРЛ и определения их значимости в клиническом применении. Аномальное метилирование промотора генов-супрессоров опухолевого роста можно рассматривать как один из функциональных маркеров канцерогенеза или как проявление процесса злокачественного перерождения опухоли [2].

Согласно теории «полей канцеризации», предложенной D. Slaughter в 1953 г., на формирование и прогрессирование опухоли влияют не только молекулярно-генетические нарушения, происходящие непосредственно в потенциально злокачественных клетках-предшественницах и приводящие к их опухолевой трансформации, но и изменения, происходящие в опухолевой строме и условно нормальных тканях, окружающих опухоль, так называемых «полях канцеризации» [9]. В слизистой оболочке пищевода «поля канцеризации» были обнаружены на расстоянии 7—10 см от очага плоскоклеточного рака, тогда как, по данным морфологического исследования, эти участки имели нормальную структуру [10]. Важное клиническое значение имеет тот факт, что «поля канцеризации» часто остаются после хирургического лечения первичной опухоли и могут привести к новым опухолевым образованиям, определяемым клиницистами как «вторая первичная опухоль» или «местный рецидив» в зависимости от точного места и временно`го интервала. Диагноз и лечение эпителиальных опухолей должны быть сосредоточены не только на опухоли, но и на области, смежной с нею [10, 11]. Наличие «полей канцеризации» описано не только для опухолей головы и шеи (полость рта, ротоглотка и гортань), но и для легкого, вульвы, пищевода, шейки матки, молочной железы, кожи, толстой кишки, желудка и мочевого пузыря [10, 12—19]. Под термином «поле канцеризации» чаще подразумевают смежной с опухолью участок ткани, клетки которого содержат структурные генетические нарушения, такие как потеря гетерозиготности, микросателлитная нестабильность и мутации. Однако показано, что помимо структурных генетических нарушений эпигенетические нарушения также обнаруживаются в «полях канцеризации» при новообразованиях различной локализации: опухолях желудка, печени, толстой кишки, пищевода, легких, молочной железы и почек [11, 13, 20—24].

Целью настоящего исследования было проведение анализа эпигенетических изменений в опухоли и окружающей ткани для определения эпигенетических изменений в различных гистологических типах НМРЛ, оценки степени распространенности исследуемых изменений в тканях, смежных с опухолью, и выявления возможных ассоциаций с клинико-морфологическими параметрами пациентов.

Для исследования использовали образцы опухоли и смежной условно нормальной ткани (парафиновые блоки) от 110 пациентов с НМРЛ, прооперированных в МНИОИ им. П.А. Герцена в период с 2011 по 2012 г. Из 110 наблюдений основными гистологическими типами оказались плоскоклеточный рак — у 48 пациентов, аденокарцинома — у 42 больных. Средний возраст пациентов составил 61 год. Клинико-морфологическая характеристика пациентов приведена в табл. 1.

После гистологического подтверждения диагноза ДНК из парафиновых блоков выделяли по протоколам коммерческих наборов («QIAGEN», Германия; ДНК-сорб-В, Россия). У 108 пациентов было получено 3 образца ДНК: опухолевая ДНК, ДНК смежной с опухолью условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли, и у 2 пациентов — образцы опухолевой ДНК и ДНК смежной с опухолью условно нормальной ткани на расстоянии 2 см от опухоли. Всего было анализировано 328 образцов ДНК.

Для оценки частоты эпигенетических изменений в образцах опухолевой ткани и смежной с ней нормальной ткани на разном расстоянии был проведен анализ аномального метилирования промоторов генов, наиболее часто повреждаемых при НМРЛ. Все гены, исследуемые в нашей работе, условно можно разделить на три основных группы: гены-супрессоры опухолевого роста: RASSF1A (3p21.3), FHIT (3p14.2), DAPK1 (9q21.33); гены, кодирующие белки межклеточного взаимодействия: CDH1 (16q22.1), CD44 (11p13), TIMP3 (22q12.3); ген системы репарации ДНК: MGMT (10q26.3).

Для выявления метилированных CpG-островков в промоторах исследуемых генов последовательно применяли рестрикционный анализ и метилчувствительную полимеразную цепную реакцию (МЧ-ПЦР). Для рестрикционного анализа образцы ДНК обрабатывали метилчувствительной рестриктазой HpaII («CибЭнзим», Россия) по следующей схеме: к 1500 нг (8 мкл) геномной ДНК добавляли 3 е.а. (1 мкл) фермента и 2 мкл соответствующего 10-кратного буфера, доводили до 20 мкл дист. водой и инкубировали в течение 10—12 ч в термостате при температуре 37 °С. Рестриктазу HpaII использовали для анализа метилирования промотора всех исследуемых генов.

При проведении МЧ-ПЦР учитывалось наличие внутренних сайтов узнавания для используемых рестриктаз в амплифицируемом участке, который содержал не менее 3—4 сайтов узнавания для HpaII. МЧ-ПЦР проводили по следующей схеме: к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 0,05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1—2 ед. термофильной ДНК-полимеразы, 5 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава (50 мМ KCl, 10 мМ трис-HCl pH 8,4, 1—5 мМ МgСl₂, 10% DMSO, 5 мМ меркаптоэтанол). Оптимальное содержание МgСl₂ в буфере подбирали экспериментальным путем для каждой пары используемых праймеров. Затем добавляли 40—60 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 94 °С в течение 10 мин и проводили 35 циклов с параметрами: денатурация — 94 °С — 40 с; отжиг и элонгация — 60—64 °С — 1 мин 30 с; финальная инкубация при 72 °С в течение 10 мин.

Нуклеотидные последовательности и температура отжига праймеров описаны ранее [25—28]. В качестве внутреннего контроля ПЦР был выбран фрагмент гена с-KIT, не содержащий сайтов узнавания для указанных рестриктаз. Продукты разделяли в 8% полиакриламидном геле (ПААГ) и окрашивали нитратом серебра. Метилирование промотора генов приведено на рис. 1, 2.

Для подтверждения метилирования использовали бисульфитное секвенирование на примере гена CDH1 (рис. 3).

Для выявления статистически достоверных ассоциаций между полученными молекулярно-генетическими изменениями и клинико-морфологическими параметрами пациентов последних делили на группы по возрасту, полу, локализации опухоли, стадии опухолевого процесса (по TNM), статусу курения, гистологическому типу, степени дифференцировки. В выделенных группах сравнивали частоту эпигенетических изменений по каждому гену с помощью двустороннего варианта точного критерия Фишера. Статистическую обработку данных проводили при помощи программы GraphPadInstat Version 3.1a.

У 104 из 110 (95%) пациентов с НМРЛ обнаружены эпигенетические изменения, по крайней мере, в одном из исследуемых генов. Частота эпигенетических изменений в опухоли составила 70% для гена RASSF1A, 52% для гена FHIT, 17% для гена DAPK1, 61% для гена CDH1, 34% для гена CD44, 43% для гена TIMP3, 15% для гена MGMT. Частота аберрантного метилирования в образцах опухоли и смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли по всем исследуемым генам приведена на рис. 4.

Эпигенетические изменения в гене TIMP3 наблюдались в опухоли и смежной с опухолью ткани на расстоянии 2 см в 24% случаев и не были обнаружены в окружающей ткани на расстоянии 5 см от опухоли. Гиперметилирование промоторов генов DAPK1 и MGMT выявлено исключительно в опухолевой ткани.

В нашем исследовании было выявлено совместное метилирование промоторов генов RASSF1A и FHIT со следующей частотой: в опухоли — 31%, в опухоли и смежной ткани на расстоянии 2 см — 16%, в опухоли и смежной ткани на расстоянии 2 и 5 см (во всех исследуемых образцах) — 12%.

При проведении статистического анализа нами получено, что метилирование промоторов генов CDH1 (p=0,002) и CD44 (p=0,002) характерно для плоскоклеточного рака легкого (табл. 2).

У 13 (12%) больных НМРЛ во всех 3 исследуемых образцах было выявлено совместное метилирование регуляторных районов генов RASSF1A и FHIT. Совместное гиперметилирование промоторов оценивалось как наличие двух полос на электрофореграмме в образце после рестрикции, соответствующих по длине генам RASSF1A и FHIT в образце без рестрикции. При проведении статистического анализа мы выявили, что совместное гиперметилирование промоторов генов RASSF1A и FHIT в опухоли и окружающей ткани на расстоянии 2 и 5 см характерно для пациентов на поздних стадиях заболевания (III—IV) с метастазами в регионарных лимфатических узлах (p=0,008) (см. табл. 2). В исследовании R. Maruyama и соавт. [29] приводятся данные, что пациенты, у которых в опухоли выявлено гиперметилирование промотора гена FHIT, имеют достоверно (p=0,007) худшие показатели выживаемости по сравнению с аналогичной группой без эпигенетических нарушений в этом гене. Схожие данные, только относительно гиперметилирования промотора гена RASSF1A, приведены в работе A. Van Den Broeck и соавт. [1]. Авторы показали, что больные НМРЛ, у которых были выявлены эпигенетические изменения в гене RASSF1A, имеют гораздо более неблагоприятный прогноз (p=0,003), чем больные без метилирования этого гена. Согласно данным нашего исследования, совместное гиперметилирование промоторов генов RASSF1A и FHIT во всех трех исследуемых образцах характерно для пациентов на поздних стадиях заболевания (III—IV) с метастазами в регионарных лимфатических узлах (p=0,008), что косвенно свидетельствует о неблагоприятном прогнозе для этих пациентов и совпадает с результатами предыдущих работ. Однако отсутствие сведений об отдаленных последствиях оперативного лечения и динамического наблюдения за пациентами затрудняет оценку прогностического значения полученных данных.

Показано статистически достоверное различие между частотой гиперметилирования промотора гена DAPK1 в группе пациентов с метастазами в регионарных лимфатических узлах и без метастазов (p=0,005). В группе пациентов с метастазами частота эпигенетических нарушений в исследуемом гене оказалась выше (см. табл. 2). Результаты нашего исследования подтверждают данные M. Ji и соавт. [7] о том, что гиперметилирование промотора гена DAPK1 ассоциировано с метастазированием, а эпигенетические изменения в гене CDH1 ассоциированы с плоскоклеточным раком легкого.

В работе J. Gu и соавт. [30] гиперметилирование промоторов генов CDH1 и TIMP3 ассоциировано с благоприятным прогнозом течения заболевания.

При анализе частоты метилирования в образцах смежной с опухолью ткани следует отметить наличие общей тенденции: в ряду опухоль → смежная с опухолью ткань на расстоянии 2 см → смежная с опухолью ткань на расстоянии 5 см; частота эпигенетических нарушений по всем исследуемым генам снижается, т.е. чем дальше от опухоли располагается окружающая ткань, тем меньше молекулярно-генетических изменений она содержит. В нашем исследовании выявлены эпигенетические нарушения в образцах ткани на расстоянии 5 см от опухоли. Вероятно, «эпигенетическое поле канцеризации» для НМРЛ не заканчивается на 5 см и необходимы дальнейшие исследования в этом направлении.

Согласно результатам нашего исследования, метилирование промотора гена TIMP3 обнаружено в опухоли у 43% пациентов, в опухоли и смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 см — у 24%, а в образцах смежной с опухолью ткани на расстоянии 5 см отсутствовало. Ген TIMP3 располагается в регионе 22q12.3, принадлежит к семейству генов, кодирующих тканевые ингибиторы металлопротеиназ, группы пептидаз, участвующих в процессах деградации экстрацеллюлярного матрикса. Метилирование промотора этого гена приводит к его инактивации и, как следствие, к активной работе тканевых металлопротеиназ, что в свою очередь приводит к разрушению тканевого матрикса и способствует инвазии опухоли в окружающие ткани. Обнаруженные нами эпигенетические нарушения в гене TIMP3 в исследуемых образцах позволяют предположить, что они способствуют инвазивному росту и метастазированию опухолевой ткани.

В нашем исследовании гены-супрессоры опухолевого роста RASSF1A и FHIT имеют более высокую частоту гиперметилирования, чем гены, кодирующие белки межклеточного взаимодействия CD44, CDH1 в нормальной ткани, отстоящей от опухоли на 5 см. В гене TIMP3 метилирование смежной ткани на расстоянии 5 см отсутствует.

Аномальное метилирование промотора гена CDH1 в образцах смежных с опухолью тканей на расстоянии 2 и 5 см составило 30 и 11% соответственно. Ген CDH1 располагается и кодирует мембранный белок E-кадгерин, гликопротеин из надсемейства кадгеринов. E-кадгерин вовлечен в механизмы регуляции межклеточной адгезии, клеточной подвижности и пролиферации эпителиальных клеток, а также имеет потенциальную супрессорную роль в клеточной инвазивности. Гиперметилирование промотора этого гена приводит к его инактивации, угнетению формирования межклеточных контактов, увеличению подвижности и пролиферативной активности клеток, способствует инвазивному росту опухоли. Наличие эпигенетических нарушений в гене CDH1 в смежной с опухолью ткани, как и в гене TIMP3, вероятно, свидетельствует о непосредственном участии опухолевого окружения в процессах канцерогенеза и о наличии «поля канцеризации». Однако, в отличие от эпигенетических изменений в гене TIMP3, аберрантное метилирование промотора гена CDH1 определяется в смежной ткани на 5 см от опухоли.

В предыдущей работе [31] мы рассматривали структурные изменения, такие как потеря гетерозиготности и микросателлитная нестабильность в хромосомных регионах, наиболее часто повреждаемых при НМРЛ. Нами показано, что исследуемые структурные нарушения определяются строго в опухоли и не затрагивают условно нормальные ткани, окружающие опухоль. Настоящее исследование показало, что эпигенетические нарушения, а именно гиперметилирование промотора исследуемых генов, характерно не только для опухоли, но и для морфологически нормальных тканей, окружающих опухоль. Наличие этих изменений в смежных с опухолью тканях свидетельствует о том, что аномальные молекулярно-генетические процессы распространяются далеко за пределы опухолевой ткани.

Изучены эпигенетические изменения в опухолевой ткани и смежной с ней нормальной ткани у пациентов с НМРЛ. Проведен анализ аномального метилирования генов RASSF1A (3p21.3), FHIT (3p14.2), DAPK1 (9q21.33), CDH1 (16q22.1), CD44 (11p13), TIMP3 (22q12.3), MGMT (10q26.3).

Обнаружена высокая частота эпигенетических изменений. У 104 (95%) из 110 пациентов с НМРЛ обнаружены эпигенетические изменения, по крайней мере, в одном из исследуемых генов. Частота эпигенетических изменений в опухоли у пациентов с НМРЛ составила 70% для гена RASSF1A, 52% для гена FHIT, 17% для гена DAPK1, 61% для гена CDH1, 34% для гена CD44, 43% для гена TIMP3, 15% для гена MGMT. Выявлены статистически значимые ассоциации между гиперметилированием промоторов генов CDH1 (p=0,002) и CD44 (p=0,002) и плоскоклеточным раком, между совместным гиперметилированием промоторов генов RASSF1A и FHIT во всех трех исследуемых образцах и поздними стадиями заболевания (III—IV) с метастазами в регионарных лимфатических узлах (p=0,008). Показано, что эпигенетические изменения в гене DAPK1 ассоциированы с метастазированием (p=0,005). Найденные эпигенетические изменения в промоторах генов RASSF1A и FHIT можно рассматривать как маркеры неблагоприятного прогноза течения заболевания, а наличие гиперметилирования промотора гена DAPK1 как маркер, ассоциированный с метастазированием.

Результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что эпигенетические изменения характерны не только для опухоли, но и для морфологически условно нормальных тканей, окружающих опухоль. Смежные с опухолью морфологически неизмененные ткани формируют «опухолевое окружение», изменения в котором в свою очередь значительно влияют на поведение самой опухоли.