Грамотрицательная бактерия Yersinia pestis — этиологический агент чумы. Сотни миллионов человек умерли в ходе трех пандемий и многочисленных локальных вспышек, зарегистрированных за последние два тысячелетия [1, 2]. Значительная угроза чумы связана с присущей ей заразностью, быстрым клиническим течением и высокой смертностью при отсутствии лечения [3]. Y. pestis относится к I-й группе патогенности и остается одним из пяти основных агентов биотерроризма [4—6].

Одним из основных факторов патогенности Y. pestis является капсульный антиген F1 (Caf1), образующий при температурах ≥37 °C белковую капсулу, препятствующую завершенному фагоцитозу и способствующую выживанию бактерии в организме хозяина [7]. Кроме того, антиген необходим для формирования поствакцинального и постинфекционного иммунитета [8, 9]. Способность препаратов F1 индуцировать активную защиту, а антител к F1 обеспечивать пассивную защиту от чумы показана на моделях мышей, крыс [10, 11] и, в меньшей степени, на нескольких видах обезьян [12].

Наши предыдущие исследования показали, что клетки штамма Y. pestis, несущие плазмиду pFSK3, продуцируют F1-антиген с повышенной способностью взаимодействовать с антителами по сравнению с F1-антигеном, полученным из штаммов Y. pestis «дикого» типа [13]. Более того, протективная активность рекомбинантного штамма превосходила в 30 раз активность коммерческой живой вакцины (Y. pestis EV НИИЭГ). Однако использованная в этом случае для клонирования капсульного антигена плазмида пестициногенности pPst (pPCP1) чумного микроба кодирует еще один мажорный белок — активатор плазминогена Pla, поэтому в настоящем исследовании сконструировали Pla^- суперпродуцент F1 антигена с повышенной серологической активностью и протективностью на основе модифицированного штамма псевдотуберкулезного микроба.

Материал и методы

Бактериальные штаммы, использованные в работе, приведены в табл. 1. Микроорганизмы выращивали на жидких и плотных питательных средах: LB (Luria Bertani broth medium: триптон — 1%, дрожжевой экстракт — 0,5%, натрий хлористый — 1%), BHI (Brain Heart Infusion, HiMedia, Индия). В случае необходимости в питательные среды добавляли канамицин — 40 мкг/мл.

Таблица 1. Штаммы микроорганизмов, используемые в исследовании

Генно-инженерные манипуляции с ДНК, а также выделение плазмидной ДНК и элекрофорез в агарозном геле проводили согласно руководству [14] и рекомендациям изготовителя ферментов (MBI Fermentas, Литва).

Электрофорез в полиакриламидном геле осуществляли по методу О. Остермана [15].

Оценку стабильности наследования плазмид проводили, как описано ранее [16]

Оценку иммуногенной активности проводили на 6—8-недельных самках беспородных мышей массой 19±1 г, содержавшихся в соответствии с ГОСТ 33216—2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными». Мышей иммунизировали двукратно подкожно различными препаратами капсульного антигена после осаждения в изоэлектрической точке или после высаливания сульфатом аммония. На 28-е сутки после второй иммунизации мышей заражали подкожно суспензией вирулентного штамма Y. pestis 231 в изотоническом растворе NaCl. Наблюдение за зараженными животными проводили в течение 21 сут. Погибших животных вскрывали и подвергали бактериологическому исследованию. Вычисление величин LD₅₀ проводили по методу Kärber в модификации И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [17].

Иммуноферментный анализ. ИФА проводили как описано ранее [18].

Статистический анализ. Данные представляли как среднее значение ± стандартное отклонение. Для статистического анализа использовали GraphPad Prism 6 (Graph Pad Software, La Jolla, CA), выполняя однофакторный дисперсионный анализ ANOVA. Различия считали достоверными, если p≤0,05.

Результаты

Для клонирования caf-оперона чумного микроба сконструировали плазмиду pPKB2 из плазмиды пестициногенности pPst (pPCP1) штамма Y. pestis EV, в которой ген, кодирующий синтез активатора плазминогена Pla, инактивировали путем вставки гена устойчивости к канамицину по сайту рестриктазы BamHI. Источником caf-оперона служила плазмида pFS1, которая представляет собой космиду pHC79 с EcoRI-фрагментом плазмиды pMT1, содержащим caf-оперон [16]. Сконструированную рекомбинантную плазмиду pPKB-F1 (рис. 1, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_02_012_add.zip) вводили в штамм Y. pseudotuberculosis 11M методом криотрансформации.

Плазмида pPKB-F1 сохранялась в клетках штамма Y. pseudotuberculosis 11M на протяжении 100—120 генераций без селективного давления (данные не представлены).

Бактериальные клетки штамма-продуцента капсульного антигена чумного микроба выращивали в течение суток в жидкой питательной среде LB с канамицином (40 мкг/мл) при температурах 28 °C и 37 °C. Наличие F1-антигена в исходных бактериальных культурах, нормированных в соответствии с оптической плотностью суспензий, определяли методом электрофореза в денатурирующих условиях (рис. 2). В качестве контрольных использовали полученный ранее рекомбинантный штамм Y. pseudotuberculosis 11М/pFSK3/9 [19] и вакцинный штамм Y. pestis EV НИИЭГ.

Рис. 2. Присутствие F1-антигена в исходных бактериальных культурах.

М — Spectra BR (Thermo Scientific, Литва); 1, 2 — Y. pestis EV НИИЭГ (28 °C и 37 °C); 3, 4 — 11M/pFSK3/9 (28 °C и 37 °C); 5, 6 — 11M/pPKB-F1 клон 1.2 (28 °C и 37 °C).

Все рекомбинантные штаммы псевдотуберкулезного микроба, EV11M/pFSK3/9 и 11M/pPKB-F1, обладали способностью к секреции капсульного антигена, причем уровни продукции были выше, чем у вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, а также не зависели от температуры культивирования.

Серологическую активность капсульного антигена в исходной бактериальной культуре, супернатанте и осадке, суспендированном в 0,9% растворе хлорида натрия, определяли в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с чумным эритроцитарным иммуноглобулиновым диагностикумом (табл. 2).

Таблица 2. Серологическая активность F1 антигена

По уровню синтеза и секреции F1-антигена штамм Y. pseudotuberculosis 11M/pPKB-F1 значительно превосходил вакцинный штамм Y. pestis EV при двух температурах выращивания, а при температуре 37 °C и полученный ранее штамм-продуцент капсульного антигена Y. pseudotuberculosis EV11M pFSK3/9. У рекомбинантных штаммов псевдотуберкулезного микроба, EV11M/pFSK3/9 и 11M/pPKB-F1, максимальную активность капсульного антигена наблюдали в надосадочной фракции бактериальных культур.

Преципитацию F1-антигена из культуральной жидкости штамма-продуцентов, выращенных в течение суток в жидкой питательной среде при температуре 28 °C, осуществили в изоэлектрической точке (pH 4,1) (рис. 3). Помимо этого выделение F1-антигена проводили путем фракционирования сульфатом аммония с последующей хроматографической очисткой.

Рис. 3. Электрофоретическая характеристика препаратов капсульного антигена.

M — Spectra BR; 1 — Штамм 11M/pPKB-F1; 2 — F1, осажденный в изоэлектрической точке; 3 — рекомбинантный F1 (0,1 мг/мл).

Чистоту полученных при использовании двух способов очистки рекомбинантных препаратов F1 характеризовали методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях при окрашивании Кумасси и нитратом серебра (рис. 4). В препаратах капсульного антигена, осажденных в изоэлектрической точке, детектировали присутствие ЛПС.

Рис. 4. Электрофоретический анализ препаратов рекомбинантного капсульного антигена, окрашенных Кумасси G-250 (а) и серебром (б).

М — Spectra BR; 1 — осадок F1, выделенный в изоэлектрической точке; 2 — F1 антиген, осажденный с помощью сульфата аммония.

При первичной (пилотной) оценке продуктивности выход антигена F1 по данным электрофореза в денатурирующих условиях составлял для штамма Y. pseudotuberculosis 11M/pPKB-F1 310 мг/л, для Y. pseudotuberculosis EV11M pFSK3/9 — 230 мг/л.

После двукратной подкожной иммунизации препаратами F1-антигена не регистрировали гибели мышей. Все животные из экспериментальных групп оставались подвижными, а поведенческие реакции были адекватными. У 100% вакцинированных животных шерсть оставалась гладкой и блестящей. Слизистые оболочки глаз и носа у всех экспериментальных мышей не имели отклонений от нормы. В месте введения вакцинных препаратов ни у одной мыши не отмечали гиперемии, отечности, некрозов и набухания региональных лимфатических узлов. Несмотря на присутствие липополисахарида (ЛПС) в препарате F1-антигена, выделенного в изоэлектрической точке, токсического эффекта не наблюдали.

Иммуногенные и протективные свойства полученных рекомбинантных белков изучили на модели бубонной чумы у беспородных мышей. Максимальный титр анти-F1-антител у вакцинированных мышей достигал (16 000±4294) для препарата антигена, осажденного в изоэлектрической точке (F1^pI), минимальный (12 000±1239) для препарата, осажденного при помощи сульфата аммония (F1^AS) (рис. 5).

Рис. 5. Реципрокные значения титров антител сывороток крови беспородных мышей против F1-антигена.

На 21-е сутки после повторного введения белков было проведено подкожное заражение мышей вирулентным штаммом Y. pestis 231 в дозах от 20 КОЕ до 2·10⁴ КОЕ. Значение LD₅₀ вирулентного штамма для мышей, иммунизированных высокоочищенным белком, составило 1,4·10⁴ КОЕ (табл. 3), индекс иммунитета — 7·10³.

Таблица 3. Протективная активность препаратов F1-антигена

Примечание. * pI — F1-антиген, осажденный в изоэлектрической точке, ** AS — F1-антиген, осажденный при помощи сульфата аммония.

У мышей, иммунизированных F1^pI-антигеном, выделенным в изоэлектрической точке, значение индекса иммунитета было практически в 2,5 раза ниже.

Обсуждение

Капсульный антиген — один из главных иммунодоминантных белков чумного микроба, синтез которого кодируется генами caf-оперона, расположенного на плазмиде pFra, и индуцируется при температуре 37 °C.

Долгое время при производстве диагностических и вакцинных препаратов использовали нативный капсульный антиген, выделенный из аттенуированных штаммов Y. pestis: EV, К-1, К-2, Tjiwidej и др. При этом ауксотрофность чумного микроба и невысокая скорость роста, наблюдаемая при температуре 37 °C, являющейся оптимальной для синтеза FI, ограничивает эффективность продукции. Плазмида пестициногенности чумного микроба мультикопийна, обладает относительно небольшим размером, высокой стабильностью наследования в клетках Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, несущих область pgm, что обусловливает возможность ее использования в качестве вектора для клонирования caf-оперона, для конструирования штаммов-продуцентов капсульного антигена. Созданная и использованная нами ранее для продукции капсульного антигена плазмида pFSK3 с caf-опероном, клонированными в плазмиде пестициногенности pPst (pPCP1) чумного микроба, кодирует еще один мажорный белок — активатор плазминогена Pla Y. pestis. В ходе выполнения настоящего исследования сконструирован плазмидный вектор pPKB-F1, лишенный балластного антигена. Известно, что инъекционное введение больших количеств гексаацилированного ЛПС людям и экспериментальным животным вызывает синдром эндотоксического шока [20], а снижение степени ацилирования липида A приводит к снижению реактогенности ЛПС [21]. Поэтому сконструированную плазмиду pPKB-F1 вводили методом криотрансформации в штамм Y. pseudotuberculosis 11М, способный продуцировать независимо от температуры культивирования только четырехацильный вариант ЛПС, не обладающий эндотоксической активностью, но сохранивший свойства адъюванта.

По нашим данным, для глубокого R-мутанта Y. pseudotuberculosis EV11M характерен кор ЛПС, который ограничивается дисахаридами Kdo→Kdo и Ko→Kdo, а также представленный в основном тетраацильной формой липида A с незначительным присутствием пентаацильной формы с дополнительным вторичным остатком кислоты 16:0. Кроме того, отсутствует существенная зависимость структуры ЛПС от температуры культивирования штамма. TNF-α-индуцирующая активность глубокого ЛПС мутанта EV11M in vitro сопоставима с активностью нетоксичного ЛПС F. tularensis. [22].

Еще одной особенностью штамма Y. pseudotuberculosis 11M является рост на простых питательных средах, что существенно удешевит получение рекомбинантного капсульного антигена. Полученный рекомбинантный штамм Y. pseudotuberculosis 11М/pPKB-F1 обеспечивал стабильную суперпродукцию капсульного антигена, не зависимую от температуры выращивания. При первичной (пилотной) оценке продуктивности выход F1-антигена у штамма Y. pseudotuberculosis 11M/pPKB-F1 в 1,35 раза превышал Y. pseudotuberculosis EV11M pFSK3/9. Возможно причиной, объясняющей повышенную по сравнению со штаммом Y. pseudotuberculosis EV11M pFSK3/9 продукцию капсульного антигена, является инактивация в плазмиде pPKB-F1 гена-активатора плазминогена, снижающая метаболическую нагрузку на клетку.

Наличие ЛПС в препаратах капсульного антигена, выделенного методом осаждения в изоэлектрической точке, положительно коррелировало со снижением протективной активности, а препарат F1, выделенный осаждением сульфатом аммония с последующей хроматографической очисткой, обеспечивал 80% защиту животных от гибели при подкожном заражении массивной дозой (2·10⁴ КОЕ) вирулентного штамма Y. pestis. Таким образом, рекомбинантный антиген Fl, выделенный из штамма Y. pseudotuberculosis 11М/pPKB-F1, обладает иммуногенностью и может быть использован в качестве ключевого антигенного компонента при разработке рекомбинантной вакцины против чумы. Кроме того, сконструированная векторная плазмида pPKB-F1 может быть использована при создании продуцирующего капсульный антиген аттенуированного штамма Y. pseudotuberculosis с перспективой разработки оральной вакцины против бубонной и легочной чумы.

Заключение

Штамм Y. pseudotuberculosis 11M/pPKB-F1 является эффективным продуцентом капсульного антигена чумного микроба. Высокоочищенный препарат F1-антигена, выделенный с помощью фракционирования сульфатом аммония, по протективным свойствам превосходит препарат, выделенный в изоэлектрической точке, и может быть потенциальным компонентом при разработке субъединичной вакцины против чумы.

Финансирование. Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской федерации (соглашение №075-15-2019-1671).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.