Введение
Среди распространенных видов травматизма ожоговая травма занимает одну из лидирующих позиций [1]. Ежегодно в США 500 тыс. человек получают такие травмы, 40 тыс. из них госпитализируют, в РФ ежегодно регистрируется порядка 315,8±8,5 тыс. термических и химических ожогов [2]. Инфекции составляют 77% всех осложнений, выявляют у 14—28% пациентов с ожогами [3] и вызывают 30—75% смертельных случаев среди больных с ожогами [2, 4, 5]. У 93% погибших больных, госпитализированных с ожогами, осложнения были обусловлены микроорганизмами с множественной резистентностью к антибиотикам, что приводило к увеличению риска смертности в 8,5—11 раз [6]. Наличие раневой ожоговой поверхности, необходимость длительной катетеризации вен, а также частые перевязки способствуют увеличению риска инфицирования ран госпитальными патогенами. При этом инфекционные осложнения могут возникать в любой период, что определяет неудовлетворительные результаты лечения, увеличение сроков нахождения в стационаре, увеличение показателей летальности, экономические потери. В этиологии инфекции у больных с ожоговой раной значимыми являются метициллинорезистентные S. aureus (MRSA), а также доминируют P. aeruginosa [7, 8]. Возникновение и передача MRSA в ожоговых центрах приводит к удлинению периода госпитализации, увеличению стоимости лечения, развитию бактериемии или сепсиса, увеличению летальности [9].
Многие патогены ответственны за инфекции в ожоговой ране, ими нередко являются Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Enterococcus spp. и грибы [8, 10, 11]. Частота выявления и устойчивость к антимикробным препаратам грамотрицательных бактерий, особенно неферментирующих, у больных с большой площадью ожогового поражения также представляют серьезную проблему [12]. Многие факторы влияют на эффективность лечения инфекционных осложнений, вызванных полирезистентными микроорганизмами, при этом чрезвычайно важно знать профиль восприимчивости, механизмы резистентности к противомикробным препаратам и преобладающий генетический клон, в том числе для оптимального клинического контроля [13]. Таким образом, выявление возбудителей инфекционных осложнений в ожоговой ране, исследование антибиотикорезистентности микроорганизмов, изучение их генетических особенностей необходимо проводить для формирования тактики профилактики и этиотропной терапии осложнений, вызванных инфекционными агентами [14].
Цель исследования — изучение механизмов резистентности основных возбудителей гнойно-воспалительных осложнений у больных с ожоговыми ранами в Красноярском краевом ожоговом центре.
Материал и методы
Объект исследования — микроорганизмы, выделенные от 90 больных с глубокими ожогами (68 мужчин, 22 женщины) в возрасте от 18 до 60 лет (средний возраст 42,23±1,28 года), которые проходили лечение в Краевой клинической больнице Красноярска с 2011 по 2017 г. Критерии включения: больные с термическими ожогами (III степень, не более 20% площади тела (п.т.)); возраст 18—60 лет. Критерии исключения: ожоги другого типа (химические, электротермические); ожог дыхательной системы; хронические, онкологические заболевания; сахарный диабет; прием глюкокортикостероидов; васкулит. Площадь ожогов I—II—III степени у больных составляла 1—30% п.т. (в среднем 9,76±0,94% п.т.), площадь ожогов III степени: до 20% п.т. (в среднем 5,32±0,5% п.т.); госпитализация в ожоговый центр в среднем 7,32±0,9 количество дней (к.д.).
Биоптаты забирали на 10—20—30—40—50-е сутки пребывания в стационаре и интраоперационно после некрэктомии. Биоптат после аутодермотранспластики забирали в месте деградации аутодермотрансплантанта (АДТ), при отсутствии деградации АДТ — из перфорированной ячейки АДТ. Идентификацию выделенных культур проводили с помощью тест-систем Remel (США), Bio Meriux (Франция), а также MALDI-TOF (Bruker, Германия). Антибиотикочувствительность определяли диско-диффузионным методом с дисками OXOID (Великобритания); методами E-теста (Bio Meriux) и серийных разведений в агаре или бульоне Мюллера—Хинтона. Штаммы из коллекции АТСС были использованы в качестве контролей.
Проводили ПЦР для подтверждения метициллинорезистентности штаммов S. aureus (MRSA, гены nuc и mecA), а также выявляли 42 гена вирулентности [15]. Изоляты MRSA генотипировали в соответствии с международными стандартами: MLST; spa, SCCmec (ПЦР, М-ПЦР) [15]. Гены резистентности к антимикробным препаратам у изолятов MRSA определяли методами ПЦР и секвенирования по Сэнгеру с применением праймеров: blaZ, tetK, tetM, aac(6/)/aph(2//), aph(3/)-IIIa, ant(4/)-Ia, aadE, spc, ErmA, ErmB, ErmC, MrsA/mrsB, gyrA, grlA, cat [16]. Плазмидный профиль (Plasmid Midi Kit, QIAGEN Sciences) изолятов MRSA определяли в горизонтальном электрофорезе (0,6—1,0%).
Гены β-лактамаз у грамотрицательных микроорганизмов выявляли в ПЦР, а также в ПЦР в режиме реального времени Rotor-Gene 6000 (Corbett Research), набор «АмплиСенс MDR MBL-FL»: blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaKPC, blaNDM, blaVIM, blaIMP, blaOXA-48, blaOXA-40-like, blaOXA-23-like, blaOXA-51-like. Выявляли интегроны класса 1 (Int1) и класса 2 (Int2). У изолятов A. baumannii выявляли гены, кодирующие пориновый белок и эффлюксный насос — ompA и adeR. У изолятов K. pneumonia — гены поринового белка ompK36.
Праймеры изготовлены в ЗАО «Евроген», ООО «Синтол»; реактивы для ПЦР — Thermo Fisher Scientific, KAPA, ООО «Синтол», ФБУН « Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора», Россия.
Статистическую обработку проводили с использованием SPSS, versium 10.07. В вариационной статистике определяли среднюю арифметическую (M), ошибку (±m), критерий Стьюдента (t), критерий Манна—Уитни, 95% доверительный интервал — ДИ (p<0,05). При описании выборки использовали медиану (Me) с интерквантильным размахом (5-й, 25-й, 75-й, 95-й процентили). При описании качественных признаков использовали абсолютные числа, доли (%), двусторонний критерий Фишера использован в сравнительном анализе.
Результаты и обсуждение
При поступлении у всех больных в материале количество микроорганизмов выявлялось в пределах 105—108 м.к./г. Установлена положительная и сильная взаимосвязь (коэффициент корреляции ρ=0,82; p<0,001) между количеством микроорганизмов перед операцией и количеством суток с момента получения травмы до прибытия в стационар (рис. 1). Рост микроорганизмов в биоптате при первом посеве выявлен у 31,0% больных, доля микроорганизмов, относящихся к грамположительным — 69,6% [95% ДИ 55,7—81,9], доля Staphylococcus aureus — 47,9% [95% ДИ 33,8—62,2]; неферментеры — 26% [95% ДИ 14,5—39,5]; доля Enterobacterales — 4,4% [95% ДИ 0,5—12,1] (рис. 2, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_04_025_add.zip). На 10-е сутки доля неферментеров — 37,6% [95% ДИ 29,7—45,9]; доля Enterobacterales — 13,6% [95% ДИ 8,4—19,9]; грамположительных микроорганизмов — 47,3% [95% ДИ 39,0—55,7]; дрожжеподобных грибов рода Candida — 1,5%. На 20-е сутки доля неферментеров — 38% [95% ДИ 28,4—48,1]; грамположительных микроорганизмов — 44,6% [95% ДИ 34,6—54,8]. На 30-е сутки доля грамположительных микроорганизмов — 51,5% [95% ДИ 39,5—63,2]; грамотрицательные микроорганизмы — 45,61%; доля неферментеров — 35,3% [95% ДИ 24,2—47,0]; дрожжеподобных грибов рода Candida — 2,9% [95% ДИ 0,3—8,2]. На 40-е сутки доля неферментеров — 53,1% [95% ДИ 36,0—69,9]; Enterobacterales — 12,5% [95% ДИ 3,5—26,0]; грамположительные микроорганизмы — 34,4% [95% ДИ 19,20—51,46]. На 50-е сутки доля Enterobacterales — 41% [95% ДИ 26,3—56,6]; доля неферментеров — 30,7% [95% ДИ 17,4—45,9]; доля грамположительных микроорганизмов — 18% [95% ДИ 7,7—31,4]; доля дрожжеподобных грибов рода Candida — 10,3% [95% ДИ 2,9—21,6] (см. рис. 2, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2022_04_025_add.zip).
Рис. 1. Зависимость количества микроорганизмов в ожоговой ране от количества суток госпитализации с момента травматизации.
Доля смешанной инфекции увеличилась с 31,0 до 57,4% (p=0,01341) при поступлении и на 10-50-е сутки лечения соответственно. В составе смешанной инфекции преобладали микроорганизмы группы ESKAPE патогенов в виде толстого налета на раневой поверхности (биопленки), при этом часто отмечалась деградация АДТ.
У изолятов неферментеров, выделенных из биоптата, установлена антибиотикорезистентность к цефалоспоринам III—IV поколений в 80,3% случаев; к ингибиторзащищенным пенициллинам — в 49,4% случаев; к карбапенемам — в 67,9% случаев; к аминогликозидам — в 59,9% случаев; к фторхинолонам II поколения — в 86,4% случаев; хлорамфениколу — в 63,5% случаев; к сульфаметоксазол/триметоприму — в 49,4% (таблица). У изолятов Enterobacterales, выделенных из биоптата, установлена антибиотикорезистентность к пенициллинам в 92,6% случаев; к ингибиторзащищенным пенициллинам — в 80,0% случаев; к цефалоспоринам III—IV поколений — в 65,8%; к карбапенемам — в 33,3%; к аминогликозидам — 83,3%; к фторхинолонам II поколения — в 69,2% случаев (см. таблицу). Все грамотрицательные изоляты сохраняли чувствительность к колистину.
Фенотипическая и генотипическая характеристика антибиотикорезистентности грамотрицательных изолятов
| Микроорганизмы | MDR, % | XDR, % | Фенотип резистентности, % | Количество изолятов на наличие генов | Гены β-лактамаз, % | Int, % | Другие гены |
| P. aeruginosa | 21,2 | 55,8 | CPZ 53,8; CAZ 76,8; FEP 73,1; IMI 67,3; MER 73,1; TCC 63,5; GEN 76,9; AMI 55,8; TOB 7,7; CIP 84,6; CM 63,5; CTZ 63,5 | 9 | VIM, 66,7; CTX-M, 22,2 | int1, 44,4 | — |
| A. baumannii | 10,3 | 72,4 | CAZ 89,7; FEP 86,2; IMI 58,6; MER 58,6; APS 24,7; GEN 44,8; AMI 51,7; CIP 89,7; CTZ 24,1 | 8 | OXA-51, 100,0; OXA-23, 25,0; OXA-24, 50,0 | int1, 62,5 | ompA, adeR |
| Enterobacterales | 17,2 | 62,1 | AMP 92,6; MC 80; CAZ 66,7; FEP 42,1; CTX 81,5; CFL 50; IMI 22,2; MER 33,3; ERM 8,3; GEN 88,7; AMI 77,8; CIP 81,5; OFL 33,3 | 2* | CTX-M, 50,0; TEM, 50,0; SHV, 100,0 | int1, 50,0 | ompK36 |
Примечание. MDR — мультирезистентные; XDR — экстремально резистентные; AMP — ампициллин; MC — амоксициллин/клавулановая кислота; CTX — цефотаксим; CAZ — цефтазидим; CPZ — цефоперазон; CFL — цефазолин; FEP — цефепим; TCC — тикарциллин-клавулановая кислота; OFL —офлоксацин; CIP — ципрофлоксацин; IMI — имипенем; ERM-эртапенем; MER — меропенем; GEN — гентамицин; AMI — амикацин; TOB — тобрамицин; CM — хлорамфеникол; CTZ- сульфаметоксазол /триметоприм; APS — ампициллин/сульбактам; * — изоляты K. pneumoniae.
Среди стафилококков, изолированных из биоптата в первые дни, MRSE не выявлены, доля MRSA — 18,2%; в более поздний период госпитализации (10—50-е дни) доля MRSE — 40%, доля MRSA — 67,7%.
Выбор сроков проведения некрэктомии, а также аутодермопластики был связан с длительностью подготовительного этапа к операции и периода до госпитализации (после травмы — 3—40 сут); более 50% больных оперированы в сроки до 20 сут. В предоперационный период больным назначали антибактериальную терапию. При этом наиболее важные модифицируемые факторы риска, связанные с инфицированием полирезистентными грамотрицательными бактериями у тяжелобольного ожогового пациента, включают предшествующее воздействие цефалоспоринов или карбапенемов и использование мочевых или артериальных катетеров, длительность госпитализации [17]. Строгие меры инфекционного контроля, постоянное наблюдение с регулярным отбором образцов тканей для количественного посева, а также раннее иссечение и закрытие раны являются основными вспомогательными средствами контроля инвазивной инфекции при ожогах [17, 18].
Изучены молекулярно-генетические механизмы резистентности у 19 грамотрицательных штаммов, устойчивых к карбапенемам или фенотипически отнесенных к продуцентам БЛРС. Штаммы A. baumannii (n=8) имели гены карбапенемазы blaOXA-51-like, поринового белка ompA и эффлюксного насоса adeR. Из числа изученных 50% обладали генами blaOXA-24-like, 25% — blaOXA-23-like. У 5 штаммов A. baumannii выявлены интегроны Int1, причем 3 из них содержали генные кассеты, размер которых составлял 2200 п.н. (см. таблицу).
Штаммы (n=9) P. aeruginosa (66,7%) имели гены карбапенемаз blaVIM, МПК для меропенема, имипенема/циластатина составила более 16 мкг/мл. Из числа изученных 22,2% штаммов имели ген blaCTX-M. У 4 штаммов P. aeruginosa выявлены Int1, при этом 3 изолята содержали генные кассеты размером 2200 п.н., 1 изолят — 1200 п.н. (см. таблицу).
Штаммы K. pneumoniae (n=2) имели гены бета-лактамаз blaSHV, гены поринового белка ompK36. 50% изолятов обладали blaTEM, 50% — blaCTX-M. Интегроны Int1 были выявлены у 1 штамма K. pneumonia, несущие генные кассеты размером 1200 п.н. и 1650 п.н. (см. таблицу).
Остальные изученные штаммы не образуют карбапенемаз, однако характеризуются резистентностью к карбапенемам. Предположительно устойчивость к данной группе препаратов обусловлена отличными от продукции β-лактамаз механизмами, такими как уменьшение проницаемости клеточной стенки, эффлюкс и др. Так, у штаммов P. aeruginosa устойчивость к меропенему может быть связана со сверхэкспрессией эффлюксной системы MexAB-OprM, а также MexXY-OprM, обеспечивающей полирезистентность. Также подчеркивают преобладающую роль инактивации белка внешней мембраны (Opr) в фенотипе карбапенемрезистентности, например OprD [19].
Тем не менее, карбапенемазы играют решающую роль в формировании резистентности. Различные классы карбапенемаз присутствуют в карбапенемрезистентных штаммах по всему миру, в основном это металло-β-лактамазы, включая VIM, IMP, AIM, SPM, GIM, SIM, DIM и NDM, а также ферменты типа KPC и OXA. У штаммов P. aeruginosa продукция карбапенемаз в мире зачастую опосредована веронским интегроном (VIM). Чаще всего выделяли VIM-2 и VIM-4, продуцирующие штаммы P. aeruginosa, обычно принадлежащие к клональным комплексам CC111 и 235 соответственно. Гены blaVIM-2 и blaVIM-4 обычно связаны с Int1. Есть и другие подтипы VIM, распространенные на глобальном уровне, такие как blaVIM-3, blaVIM-5, blaVIM-6, blaVIM-7, blaVIM-11, blaVIM-14, blaVIM-15, blaVIM-16 и blaVIM-18 [19]. Так, в г. Москве и других регионах РФ среди грамотрицательных бактерий выявлены гены β-лактамаз: SHV (25%), TEM (35%), CTX-M (38%), OXA (31%), NDM (2%), VIM (3%); Int1 (59%) и Int2 (8%) с кассетами (aacA4, aadB, aacC1, aadA2, aadA1, aadA5, dfrA1, dfrA12, dfrA7, orfE, orfC,orfY, blaVIM-2, sat1), ассоциированными с устойчивостью к аминогликозидам, хлорамфениколу, сульфаниламидам и др. [20].
В различных странах мира у карбапенемрезистентных штаммов A. baumannii среди механизмов, определяющих низкую чувствительность к β-лактамам, доминируют детерминанты устойчивости типа OXA (53,2%; 95% ДИ=60, 80,0%, I2=86,0%), за которым следует механизм продукции металло-β-лактамаз (МБЛ) (30,2%; 95% ДИ 11, 42,0%, I2=93,0%) и карбапенемаз KPC (16,6%; 95% ДИ 5, 63,0%, I2=88,0%). Среди A. baumannii, продуцирующих OXA, ген blaOXA-23 является наиболее распространенным, с частотой встречаемости 65,4—100% [21, 22]. Другие приобретенные карбапенемазы OXA-типа были идентифицированы в исследованиях с меньшей частотой: blaOXA-24/40-like (3,7—100%) и blaOXA-58-like (3,0—100%) [23, 24]. Среди МБЛ доминировала металло-бета-лактамаза VIM, которая выявлена у порядка 70,0% изолятов, а также выявляли гены blaIMP-1 (5,3%) и blaSPM (3,5%) [25, 26]. Наличие двух карбапенемаз в одном изоляте — распространенное явление, при этом выявляли следующие комбинации: blaOXA-23/blaOXA-24/40 (9,0—48,1%); blaOXA-23/blaOXA-58 (3,0%); blaOXA-23/blaKPC (9,2—10,0%); blaOXA-23/blaVIM (9,2—10,0%) [22]. Выделяют роль сверхэкспрессии эффлюксной системы AdeABC и потерю белка внешней мембраны клеточной стенки CarO [11, 27].
Важным является горизонтальный перенос генов с помощью мобильных генетических элементов — транспозонов, плазмид, интегронов с генами устойчивости к противомикробным препаратам. Интегроны играют важную роль в приобретении, экспрессии и распространении генов устойчивости к антибиотикам среди различных бактериальных штаммов. Существуют разные классы интегронов, включая классы 1, 2 и 3; однако Int1 являются преобладающим типом в клинических изолятах. Интегроны несут гены, участвующие в различных механизмах устойчивости к антибиотикам [28]. Так, интегрон Int1 среди штаммов P. aeruginosa, вызывающих инфекции у больных с ожогами, обнаружен в 40,0—96,9% случаев, при этом выявлена корреляция между наличием Int1 и устойчивостью к антибиотикам. Кроме того, прослеживается связь между присутствием в штаммах Int1 и развитием инфекций в ожоговом отделении. Сообщалось также о значительной корреляции между присутствием интегронов и устойчивостью к имипенему, цефтазидиму, пиперациллину, ципрофлоксацину, цефотаксиму, азтреонаму, тобрамицину, тикарциллину и др. [29]. Среди штаммов P. aeruginosa, выделяемых в Москве, выявлены гены β-лактамаз как широко распространенных в России blaVIM-2-like (37,7%), так и впервые выявленных blaCTX-M-15 (3,0%); а также Int1 (63,0%) с генными кассетами: aadA6-gcuD, blaVIM-2-like, aacA7-blaVIM-2-like, aadA6Δ3:ISPa21e-gcuD, aac(3’)Ic-cmlA5, blaPBL-1-aacA4, gcu87-aadB-aphA15d-aadA1a [30].
Изучены молекулярно-генетические механизмы резистентности у 10 изолятов MRSA PVL-ST239;spat037;agr1;SCCmecIII.1.1.2;tst. Показано, что резистентность к фторхинолонам обусловлена мутациями в хромосомных генах grlA (Ser80Phe) и gyrA (Ser84Leu); данный механизм обусловлен модификацией мишени действия ферментов бактерий: топоизомеразы IV, ДНК-гиразы. Резистентность к рифампицину обусловлена мутациями в гене rpoB, локализованном в хромосоме (Ile527Met, His481Asn), резистентность к канамицину, гентамицину — аминогликозидмодифицирующими ферментами (гены aacA-aphD). Резистентность к неомицину обусловлена наличием гена aadD, контролирующим синтез ферментов нуклеотидилтрансферазы, аденилилтрансферазы, модифицирующих аминогликозиды. Ген tetM определяет устойчивость к тетрациклинам, так как обеспечивает защиту рибосом. Гены ermA и ermC кодируют метилазу, вызывающую невосприимчивость к линкозамидам (клиндамицин), макролидам (эритромицин). Резистентность к хлорамфениколу обусловлена геном cat, кодирующим синтез хлорамфениколацетилтрансферазы, локализованном в плазмиде, размером 2,9 т.п.н. Выделенные штаммы оказались чувствительными к линезолиду и ванкомицину (МПК 0,5 мкг/мл). Изоляты (n=2) характеризовались высоким уровнем частоты (10–7) передачи генов резистентности, локализованных в транспозонах и плазмидах, способствующих распространению антибиотикорезистентности.
Заключение
Таким образом, в ожоговом центре Красноярской краевой больницы выявлена взаимосвязь между концентрацией микроорганизмов и спектром возбудителей гнойных осложнений и продолжительностью госпитализации пациента, давностью травмы. В 1-е сутки одним и лидирующих возбудителей, представленном и в ассоциациях, выявлен MRSA (47,9% [95% ДИ 33,8—62,2]), далее увеличивается значимость ассоциаций (с 31,0% [95% ДИ 15,2—49,5] до 69,2% [95% ДИ 19,0—40,2]) антибиотикорезистентных грамотрицательных бактерий (P. aeruginosa, A. baumannii и др.) в сочетаниях с MRSA, что соответствует общемировым тенденциям. При планировании и проведении эмпирической терапии гнойных осложнений у больных с ожогами этот факт важно учитывать. При подборе эмпирической антибактериальной терапии такого рода осложнений необходимо придерживаться принципа комбинирования препаратов, деэскалации, учета возможной этиологии. Также важно учесть, что не всегда есть возможность применять оптимальную антибактериальную терапию, что связано с физиологическими изменениями, такими как баланс жидкости, почечная и печеночная дисфункция, а также с длительностью лечения и др. Возможно использование антисептических средств местного характера, таких как бактерицидные вещества, физические методы обработки ран, которые разрушают защитный матрикс, не обеспечивают стерилизацию, однако способствуют уменьшению количества микроорганизмов, тем самым снижая риск развития инфекционных осложнений.
Установлено наличие различных β-лактамаз, в том числе карбапенемаз, а также других механизмов резистентности среди карбапенемрезистентных штаммов P. aeruginosa, A. baumannii и K. pneumoniae, выделенных от пациентов с ожогами. Резистентность изолятов MRSA обусловлена наличием генов резистентности, мутациями в хромосомных генах.
Авторы выражают благодарность: PhD, MD, проф. Т. Ямамото (IMERC, Япония), к.б.н., доц. О.В. Перьяновой и Н.К. Поткиной (ФГБОУ ВО «КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России).
Работа выполнена в рамках НИР 072 Роспотребнадзора «Молекулярно-генетические механизмы вирулентности и резистентности бактерий к антибактериальным препаратам».
Исследование проведено согласно международным требованиям локального этического комитета ГБОУ ВПО «КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России (№28/2010) и выполнено с информированного согласия пациентов.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.