Белок p53 вместе с p63 и p73 составляет семейство транскрипционных факторов, которые регулируют фундаментальные процессы, включая пролиферацию, дифференцировку, старение и гибель клеток [1]. Семейство p53 было широко изучено в области туморогенеза, но роль членов семейства в постмитотических нейронах до сих пор изучена недостаточно. Некоторые исследования предполагают, что это семейство может участвовать как в процессе развития нейронов, так и в нейродегенерации [2, 3]. Белок p53 является активатором транскрипции определенного набора генов-мишеней, ингибирующим клеточный цикл регуляторным фактором и эффектором клеточных ответов на повреждения, которые включают остановку клеточного цикла и апоптоз [4]. Вместе с тем p53 является нейропротектором в модели тауопатии in vivo. Было показано, что p53 контролирует транскрипцию группы генов, участвующих в синаптической функции. Транскрипционный контроль p53 этих синаптических генов сохраняется в мышиных нейронах и человеческом мозге [3]. Поврежденные (темные) нейроны имеют специфические морфологические признаки: усохшая цитоплазма, сморщенное ядро с сегментированным хроматином и неровными границами, штопорообразный аксон [5, 6]. Считается, что в этих нейронах произошел запуск запрограммированной гибели клеток [7]. Однако не исключается, что темные нейроны при определенных условиях способны к восстановлению своего морфофункционального состояния [5].

Моделирование прямых и опосредованных стрессовых воздействий на головной мозг приводит к нарушению функционального состояния нейронов с последующими морфологическими изменениями [8]. Особое внимание при стрессе уделяется гиппокампу [9—11]. Нейроны его пирамидного слоя чувствительны к различным стрессовым факторам, в том числе и при хирургическом стрессе. Так было показано, что моделирование хирургических манипуляций в полости носа у крыс провоцирует экспрессию белка p53 в нейронах гиппокампа и появление темных нейронов. При этом исследований, оценивающих одновременность этих процессов при моделировании септопластики у крыс, не проводилось.

Цель исследования — в настоящем исследовании оценивается зависимость экспрессии белка p53 от появления темных нейронов в гиппокампе у крыс при экспериментальном моделировании септопластики.

Материал и методы

Хирургическое вмешательство. Работа проведена на 20 половозрелых крысах-самцах линии Wistar массой 205,25±10,15 г. Контрольную группу составили 5 крыс. За 10 мин до операции 15 крысам, которые составили экспериментальную группу, в целях общей анестезии внутрибрюшинно вводили раствор золетила 100 в дозировке 15 мг/кг. Моделирование септопластики проводили стандартным методом путем зигзагообразной скарификации слизистой оболочки полости носа (рис. 1) [12].

Рис. 1. Схема проведения моделирования септопластики.

Стрелками указано направление скарификации слизистой оболочки перегородки носа.

Иммуногистохимическая и гистологическая оценка головного мозга. В экспериментальной группе как и в контрольной, гуманную эвтаназию проводили на 2, 6 и 14-е сутки после операции, по 5 особей путем введения летальных доз золетила 100. Фиксацию головного мозга как в контрольной, так и в экспериментальной группах, проводили до трепанации черепа путем введения через сердце физиологического раствора, а затем 10% раствора формалина в течение 5—10 мин. После трепанации черепа головной мозг фиксировали 10% раствором формалина, после чего заключали в парафиновые блоки. Получали 8 срезов головного мозга во фронтальной плоскости толщиной 4 мкм от каждой крысы и окрашивали препараты — 4 среза методами иммуногистохимии к белку p53 с докрашиванием гематоксилином Майера и 4 среза толуидиновым синим по Нисслю. Окрашенные стекла заключали в специальную полимерную ленту. Затем проводили анализ полученных срезов в световом микроскопе.

Изучали субполя гиппокампа СА1, СА2, СА3 и зубчатую извилину (DG) (рис. 2). В пирамидном слое субполей подсчитывали абсолютное количество нейронов, у которых была положительная ядерная реакция с антителами к белку p53, а также количество темных нейронов.

Рис. 2. Расположение субполей гиппокампа (СА1, СА2, СА3) и зубчатой извилины (DG) крысы.

Иммуногистохимическая реакция анти-p53 с докрашиванием гематоксилином Майера. Ув. ×100.

Статистический анализ. Полученные данные с помощью методов подсчета клеток были представлены как среднее значение ± SE. Затем их сравнивали между обеими группами с помощью t-теста с SPSS 21software.

Работа выполнена в соответствии с Хельсинкской декларацией 1975 г. и ее пересмотренным вариантом 2000 г.

Результаты и обсуждение

p53-позитивные нейроны. Согласно критерию Манна—Уитни, в субполе гиппокампа СА1 количество p53-позитивных нейронов достоверно повысилось на 2, 4 (p<0,001) и 6-й дни (p<0,05) после проведения моделирования септопластики, по сравнению с контрольной группой. В динамике пик роста экспрессии белка p53 в цитоплазме пирамидного слоя СА1 и СА2 гиппокампа пришелся на 2—4-е сутки после операции, а на 6-й день количество этих нейронов значимо снизилось (p<0,001). При этом в субполе СА2 на 6-й день по p53-позитивным нейронам экспериментальная группа не отличалась от контрольной (рис. 3, а). В пирамидном слое субполя СА3 на всех сроках после хирургического вмешательства была отмечена повышенная стойкая экспрессия в цитоплазме нейронов белка p53 по сравнению с контрольной группой (p<0,001).

Рис. 3. Динамика изменения количества p53-позитивных нейронов (p53) (а) и темных нейронов (б) при моделировании септопластики.

* — достоверные различия между данными контрольной группы и сроками после операции (p<0,001) — достоверные различия между данными контрольной группы и сроками после операции (p<0,05); ^† — достоверные различия между сроками после операции внутри экспериментальной группы (p<0,001); ^‡ — достоверные различия между сроками после операции внутри экспериментальной группы (p<0,05).

В зубчатой извилине, по сравнению с интактными крысами, количество p53-позитивных нейронов было значимо выше на всех сроках оценки. При этом пик численности этих клеток пришелся на 4-й день по сравнению с остальными постоперационными сроками (p<0,001) (см. рис. 3, а).

Темные нейроны. По количеству ТН в пирамидном слое гиппокампа в экспериментальной и контрольной группах распределение данных было не гаусово. В пирамидном слое субполя СА1 количество темных нейронов на 2 и 4-й постоперационные дни достоверно не отличалось от контрольной группы, но на 6-й день после моделирования септопластики было отмечено снижение их количества (p<0,001). В субполе СА2 экспериментальная группа от контрольной значимо не различалась. При этом через 2 сут после операции был отмечен минимум количества темных нейронов по сравнению с 4-м днем (p<0,001). В субполе СА3 на 4-й день после операции наблюдался пик численности ТН в пирамидном слое по сравнению с остальными днями (p<0,001). В контрольной группе количество ТН не отличалось от 2-го дня, но было достоверно ниже по сравнению с 4-м (p<0,001) и 6-м (p<0,05) днями после операции (см. рис. 3, б).

В DG наблюдались схожие с СА3 результаты. Так, на всех сроках после септопластики ТН было значимо больше, чем в контрольной группе (p<0,001). На 4-й день произошло резкое увеличение количества ТН по сравнению со 2-м днем, а затем — отрицательная динамика на 6-й день (p<0,001) (см. рис. 3, б).

Корреляция между p53-позитивными и темными нейронами. Сопоставляя количество нейронов, в которых белок p53 экспрессировался в цитоплазму, и количество темных нейронов, была обнаружена положительная сильная связь на всех сроках оценки и во всех субполях гиппокампа (табл. 1). Самый низкий коэффициент детерминации был обнаружен при оценке субполя СА2 на 4-й день после операции.

Корреляция между количеством темных нейронов (ТН) и количеством p53-позитивных нейронов (p53) в гиппокамповой формации после моделирования септопластики

Неизбежным фактором, влияющим на органы, является стресс [8, 13—15]. Апоптоз нейронов возникает при различных физиологических и патологических процессах и является генетически контролируемой формой гибели клеток [16]. Например, после воздействия стрессовых факторов в гиппокампе были обнаружены TUNEL-положительные (апоптотические) нейроны, этот факт указывает на то, что воздействие стресса, в том числе и хронического, оказывает повреждающее воздействие на нейроны гиппокампа [11].

Формирование темных нейронов в субполях СА1 и СА3 гиппокампа крыс в настоящем исследовании, по-видимому, является типовой реакцией на стресс, в том числе и сопровождающийся воспалительными реакциями. Так, ранее было показано, что при моделировании острого перитонита у свиней и крыс в субполях СА1 и СА2 также наблюдается образование темных нейронов [17]. Это связывают с запуском механизмов апоптоза, так как рост количества ТН коррелирует с положительными TUNEL-нейронами [15]. Другие исследования также подтверждают, что сморщивание нейрона и его базофилия могут служить надежными критериями начинающейся его дегенерации [17, 18].

Так, p53 активируется клеточным стрессом и повреждением ДНК и в зависимости от тяжести стресса и конкретного типа клеток может способствовать адаптивным ответам на стресс или может запускать остановку клеточного цикла или апоптоз [19]. Когда нормальные пролиферирующие клетки подвергаются повреждению ДНК, они реагируют одним из двух способов: остановка клеточного цикла или апоптоз, и p53 участвует в обоих этих процессах [20]. Иногда незрелые нейроны, как, например, в мозжечке, могут подвергаться апоптозу через страуроспориновый путь, минуя активацию p53-зависимого гена [21]. Воздействие клеточного стресса может вызвать опухолевый супрессор p53, специфичный к последовательности транскрипционный фактор, который вызывает остановку роста клеток или апоптоз. Выбор между этими клеточными реакциями зависит от многих факторов, включая тип клетки и стресс, а также действие p53 соактиваторов. Так, p53 стимулирует широкую сеть сигналов, которые действуют через два основных апоптотических пути. Внешний (рецепторный) путь гибели запускает активацию каспазы-3, а внутренний (митохондриальный) путь сдвигает баланс в семействе Bcl-2 в сторону проапоптотических членов, способствуя образованию апоптосомы и, следовательно, опосредованному каспазой апоптозу. Воздействие этих двух апоптотических путей может быть усилено, когда они сходятся через Bid, который является мишенью p53. Большинство этих апоптотических эффектов опосредовано через индуцирование специфических генов-мишеней апоптоза. Однако p53 может также способствовать апоптозу с помощью транскрипционно-независимого механизма при определенных условиях [22]. Исследования клеточных культур установили сильную корреляцию между экспрессией p53 и эксайтотоксической гибелью нейронов, вызванной глутаматом, N-метил-D-аспартатом (NMDA), агонистом рецептора NMDA хинолиновой кислотой и каиновой кислотой [23, 24].

Кроме широко изученной роли p53 как регулятора запуска апоптоза, была продемонстрирована и его нейропротективная роль [25]. Так, результаты P. Merlo и соавт. предполагают, что синаптическая функция является важной мишенью p53 в нейропротекции при некоторых нейродегенеративных заболеваниях [3]; p53 контролирует транскрипцию генов, кодирующих ключевые белки экзоцитоза синаптических пузырьков и рециркуляции. Это указывает на новый аспект ответа p53 на клеточное повреждение и предполагает защитный молекулярный механизм против одного из первых проявлений нейродегенерации. Предполагается, что вместо того, чтобы способствовать гибели клеток, p53 может быть частью древней и консервативной защитной реакции на стресс, которая действует в стрессовых состояниях для защиты нейронов и поддержания критических нейронных систем, включая синаптическую функцию [3].

Так как p53 является транскрипционным фактором, регулирующим, возможно, несколько тысяч генов с различными биологическими функциями, можно предположить, что более глубокие пути ждут своего объяснения [26]. Дефицит p53 приводит к более медленной пролиферации нейрональных стволовых клеток, потенциально из-за длительной фазы G2 [27]. Кроме того, было показано, что p53 служит для смягчения нарушения развития нейронов после облучения и таким образом может играть существенную роль в регулировании поздних эффектов в мозге после проведения радиотерапии [28].

Показано, что p53 регулирует некротическую гибель и аутофагическую активность нейронов [29]. Так, p53 независимо от транскрипции изменяет проницаемость мембран митохондрий, взаимодействуя с белками митохондриальных пор — MPTP [30] и VDAC [31].

В предыдущих исследованиях нами было продемонстрировано, что при моделировании септопластики в гиппокампе у крыс встречаются нейроны, в которых белок p53 появляется как исключительно в цитоплазме, так и в ядре. В последнем случае нейроны носили характерные морфологические признаки дегенерации — склеивание хроматина, нечеткость границ ядра, а в ряде случаев и распад клетки [6]. Можно предположить, что p53 может и не носить исключительно роль регулятора апоптоза.

Ранее также было показано, что темные нейроны могут как восстанавливать свое морфофункциональное состояние за счет увеличения цистерн гранулярной эндоплазматической сети с образованием мембранных завитков с переходом этого процесса на астроцитарные отростки и, как следствие, с последующим снижением степени структурного уплотнения клетки [5], так и быть признаком конечного некротического распада клетки независимо от причины гибели нейрона, в том числе и от различных биохимических каскадов апоптоза [7]. На примере различных моделей эпилептического статуса у крыс было продемонстрировано, что в гиппокампе появляются TUNEL-позитивные пирамидные нейроны с усохшей цитоплазмой. Авторы делают вывод о запуске запрограмированной гибели клеток с последующим вторичным некрозом по отношению к повреждающему фактору. При этом маркеры апоптоза могут появляться и в отсроченном режиме [32], особенно после нейрональных повреждений, индуцированных кортикотропин-релизинг гормоном [33], что в дальнейшей перспективе может привести к различным нейробиологическим последствиям — нарушению памяти, поведенческих реакций и др. [34]. Ранее нами было показано, что моделирование септопластики у крыс провоцирует повышение тонуса симпатической нервной системы и концентрации кортикостерона в плазме крови в течение первых 4—5 дней после операции [35], что косвенно свидетельствует о наличии причинно-следственных связей между нарушением баланса вегетативной нервной системы, активацией гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, появлением «темных» и p52-позитивных нейронов в пирамидном слое гиппокампа и, как следствие, нарушений поведенческих реакций. Кроме того, в предыдущих исследованиях нами были получены результаты, демонстрирующие, что при таком виде хирургических вмешательств развивается тревожное состояние у крыс [12], что можно связать не только с развитием общих воспалительных реакций, но и с сенсорной депривацией периферического отдела обонятельного анализатора [6].

Обнаруженные нами в настоящем исследовании высокие коэффициенты детерминации подтверждают теорию о том, что вероятнее всего появление темных нейронов в гиппокампе и зубчатой извилине тесно связано с экспрессией белка p53 при хирургическом стрессе, спровоцированном моделированием септопластики у крыс.

Заключение

Появление темных и p53-позитивных нейронов в гиппокампальной формации у крыс после моделирования септопластики являются типовыми ответными реакциями нервной ткани на стресс. Очевидно, что экспрессия белка p53 связана с базофилией цитоплазмы нейронов, их морфофункциональным состоянием. Предположительно, белок p53 может запускать не только активацию поврежденных нейронов в гиппокампе, но и играть нейропротективную роль. Предстоящие исследования должны определить роль белка p53 в дальнейшей судьбе поврежденных нейронов в пирамидном слое и дифференцировать механизмы его экспрессии.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.