Введение

С ростом числа антибиотикорезистентных микроорганизмов во всем мире существует острая необходимость в поиске новых стратегий, направленных на инактивацию патогенов и обеспечение низкого потенциала развития их резистентности. Антимикробная фотодинамическая терапия (аФДТ) — это новый подход к уничтожению патогенов, который не зависит от существующего статуса устойчивости к антибиотикам и в силу своей неспецифичности не предполагает развитие резистентности [1].

Метод аФДТ основан на возбуждении фотосенсибилизатора (ФС) светом с последующей наработкой активных форм кислорода (АФК) [2]. АФК способны разрушать биомолекулы (липиды, белки, нуклеиновые кислоты), вызывая лизис клеток микроорганизмов и их гибель. Преимущественное нацеливание на клетки микроорганизмов в сравнении с клетками млекопитающих обеспечивается выбором подходящей структуры ФС [3]. Дополнительная селективность метода может быть обеспечена посредством местного введения ФС в инфицированную область и ограничением зоны светового воздействия. Существует большое разнообразие ФС, которое включает как широко известные хромофоры, такие как метиленовый синий [4], роза бенгальская [5], индоцианин зеленый [6], так и, например, новые катионные производные тетрапиррольных структур — порфирины [7], фталоцианины [8] и бактериохлорины [9]. Данные соединения обладают достаточно высокой антибактериальной световой активностью, однако им присуща и темновая токсичность в отношении клеток эукариот, что лимитирует их применение в методе аФДТ.

Рибофлавин (Рф) является природным фотосенсибилизатором (ФС), который способен генерировать больше синглетного кислорода, чем многие синтетические ФС [10]. Благодаря своим фотохимическим свойствам и способности вырабатывать активные формы кислорода (АФК), показана высокая эффективность Рф для противоопухолевой терапии при облучении ультрафиолетовым (УФ) и синим светом [11]. Кроме того, его фотоактивация возможна светом ближнего инфракрасного излучения, например, за счет конъюгации с апконвертирующими наночастицами, что позволяет образовывать АФК на глубине биоткани до 1 см [12]. Отсутствие темновой токсичности и мутагенности Рф позволяет использовать его фотосенсибилизирующие свойства в клинической практике для инактивации патогенов в плазме крови, обеспечивая снижение рисков заражения инфекциями при трансфузии [13].

Из-за ограниченной глубины проникновения света в биоткани, метод аФДТ наиболее перспективен при лечении поверхностных ран. При этом особенно важно обеспечивать контролируемую диффузию аплицируемых на рану препаратов, которая определяется молекулярной массой соединения [14]. В данной работе мы использовали как низкомолекулярное производное рибофлавина (Рф, мол. масса 456), так и синтезированное нами соединение Рф-ПЭГ (мол. масса 2376) для изучения их фотосенсибилизирующих свойств в отношении клинических изолятов Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и Salmonella typhimurium в условиях in vitro. Противовирусная активность фотосенсибилизатора была исследована на препарате колифага.

Материалы и методы

В работе использовали флавинмононуклеотид (ФМН) производства ОАО «Фармстандарт — УфаВИТА» (Россия) и рибофлавин производства «Сигма» (Германия). Для синтеза конъюгата Рф-ПЭГ были использованы уксусная кислота, уксусный ангидрид, хлорная кислота, трет-бутилбромацетат, диметилфорамид, карбонат цезия, ПЭГ-2000, трифторуксусная кислота, дихлорметан, хлороформ, метанол, соляная кислота, N-гидроксисукцинимид, 4-диметиламинопиридин, диизопропилэтиламин производства «Сигма» (Германия).

Масс-спектрометрический анализ проводили на времяпролетном МАЛДИ-масс-спектрометре Ultraflextreme (Bruker Daltonics, Billerica, MA, США).

Облучение клинических изолятов проводили светодиодом с максимумом на длине волны 365 нм («Полироник», Россия). Доза облучения в экспериментах составляла 30 Дж/см².

Бактериальные штаммы и бактериофаг. Клинические изоляты Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и Salmonella typhimurium были получены из коллекции ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Для оценки фототоксических свойств флавинмононуклеотида использовали фаговый препарат (колифаг — «Пиобактериофаг поливалентный очищенный») производства «Микроген» (Россия).

Для приготовления питательной среды использовали 1,5% раствор агара в LB-бульоне производства Difco (США).

Фотоинактивация планктонных бактерий и фага. В чашку Петри с 2 мл бульонной культуры вносили по 0,2 мг исследуемого вещества и оставляли в течение 15 мин. В контрольные чашки препарат не добавляли. После часа облучения бульонную культуру из каждой чашки титровали методом серийных разведений и высевали на чашки Петри для определения КОЕ/мл. Для исследования противовирусной активности фотосенсибилизатора в чашку петри с 2 мл фагового препарата вносили по 0,2 мг исследуемого вещества и облучали в течение 1 ч. Количество активных фаговых частиц после облучения определяли методом Грация.

Метод стекающей капли. Каплю ночной бульонной культуры наносили на плотную питательную среду и давали стечь, наклонив чашку Петри под углом 45°. Далее на «дорожку бактериальной культуры» наносили ФМН и облучали в течение 1 ч.

Результаты и обсуждение

Рф представляет собой слаборастворимые в воде кристаллы, поэтому для оценки антибактериальных свойств была выбрана его водорастворимая форма — ФМН. Для увеличения молекулярного веса Рф и получения водорастворимого конъюгата использовался полиэтиленгликоль (ПЭГ). ПЭГ представлен водорастворимыми, нетоксичными и биосовместимыми полимерами, применяемыми в производстве фармацевтических препаратов. Конъюгация с ПЭГ используется для улучшения растворимости и стабильности, уменьшения иммуногенности и частоты дозирования препаратов. Поэтому мы ожидали, что конъюгация Рф с ПЭГ будет способствовать улучшению его гидрофильности и создаст стерический барьер, ограничивающий взаимодействие с белками плазмы.

Водорастворимый высокомолекулярный конъюгат Рф-ПЭГ был синтезирован по следующей методике.

На первом этапе для инактивации гидроксильных групп в остатке рибитола и улучшения растворимости при дальнейших модификациях рибофлавина был получен 2’,3’,4’,5’-тетраацетилрибофлавин путем нагрева коммерческого рибофлавина до 40 °C с обратным холодильником в смеси уксусная кислота/уксусный ангидрид, 1/1, в присутствии каталитического количества 57% хлорной кислоты. Полученный 2’,3’,4’,5’-тетраацетилрибофлавин очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле системой растворителей CHCl₃/MeOH=12/1. Выход соединения составил 90%. Структура 2’,3’,4’,5’-тетраацетилрибофлавина была подтверждена спектроскопией ЯМР (см. приложение 1). В спектре присутствовали сигналы: 2.25 (с, 3Н, Ас), 2.18 (с, 3Н, Ас), 2.04 (с, 3Н, Ас), 1.71 (с, 3Н, Ас).

Модификацию защищенного рибофлавина проводили по 3-положению изоаллоксазинового макроцикла. Нуклеофильное замещение тетраацетилрибофлавина проводили трет-бутилбромацетатом в абсолютном ДМФА в присутствии карбоната цезия в качестве основания с получением продукта N³-трет-бутоксиметил-2’,3’,4’,5’-тетраацетилрибофлавина. Полученный N³-трет-бутоксиметил-2’,3’,4’,5’-тетраацетилрибофлавин очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле системой растворителей CHCl₃/MeOH=8/1. Выход соединения составлял 91%. Структура N³-трет-бутоксиметил-2’,3’,4’,5’-тетраацетилрибофлавина была подтверждена спектроскопией ЯМР. В спектре присутствовали сигналы: 4.67 (c, 2H, CH₂-COOtBu), 1.12 (с, 9Н, tBu).

Для создания амидной связи с ПЭГ получали свободную карбоксильную группу путем удаления трет-бутильной защитной группы в карбоксиметильном остатке трифторуксусной кислотой в растворе дихлорметана. Полученный N³-карбоксиметил-2’,3’,4’,5’-тетраацетилрибофлавин очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле системой растворителей CHCl₃/MeOH=5/1. Выход соединения составлял 94%. Структура N³-карбоксиметил-2’,3’,4’,5’-тетраацетилрибофлавина была подтверждена спектроскопией ЯМР. В спектре отсутствовал сигнал 1.12 (с, 9Н, tBu).

Для активации карбоксильной группы использовали метод активированных эфиров, для этого полученный N³-карбоксиметил-2’,3’,4’,5’-тетраацетилрибофлавин растворяли в ДМФА и обрабатывали гидрохлоридом 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида при перемешивании в течение 4 ч при комнатной температуре. Реакцию пэгилирования активированного эфира N³-карбоксиметил-2’,3’,4’,5’-тетраацетилрибофлавина проводили с гетеробифункциональным полиэтиленгликолем NH₂-PEG₂₀₀₀-OMe в ДМФА с использованием диизопропилэтиламина в каталитических количествах. Полученный пэгилированный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле системой растворителей CHCl₃/MeOH=4/1. Выход соединения составил 57%. Структура 5-(ПЭГ₂₀₀₀-амидометил)-2’,3’,4’,5’-тетраацетилрибофлавина была подтверждена спектроскопией ЯМР. В спектре присутствовал сигнал: 3.75 (c, 180Н, ПЭГ-H).

На последнем этапе было необходимо гидролизовать сложноэфирные группы в остатке рибитола действием п-толуолсульфокислоты в метаноле в течение 5 ч при кипении. Полученный раствор соединения упаривали досуха, затем растворяли в минимальном количестве насыщенного раствора бикарбоната натрия и осаждали концентрированной HCl. Образовавшийся осадок соединения фильтровали и промывали изопропанолом и гексаном. Выход соединения составлял 63%. Структура 5-(ПЭГ₂₀₀₀-амидометил)-рибофлавина была подтверждена спектроскопией ЯМР. В спектре отсутствовали сигналы: 2.25 (с, 3Н, Ас), 2.18 (с, 3Н, Ас), 2.04 (с, 3Н, Ас), 1.71 (с, 3Н, Ас).

Дополнительно как синтезированный конъюгат, так и ФМН, были исследованы с помощью масс-спектрометрии (рис. 1). Масс-спектры показали наличие характеристических пиков ФМН (см. рис. 1, а) и Рф (см. рис. 1, б) в исследуемых образцах. На рис. 1, в представлена область, соответствующая ПЭГ в образце конъюгата ПЭГ-Рф.

Рис. 1. Масс-спектры флавинмононуклеотида (а), коньюгата рибофлавин-полиэтиленгликоль (б) и область спектра Рф-ПЭГ, соответствующая высокомолекулярному ПЭГ (в).

Была проведена оценка антибактериальной и антивирусной активности ФМН и конъюгата Рф-ПЭГ на планктонных культурах патогенных микроорганизмов Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella typhimurium и на бактериофаге (колифаг).

Проведенные исследования показали, что ФМН и Рф-ПЭГ обладают ярко выраженными антибактериальными свойствами, что проявляется значительным подавлением количества КОЕ исследуемых бактерий (см. таблицу). Полученные результаты демонстрируют практически полное подавление роста Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и Salmonella typhimurium при использовании ФМН. При этом в негативных контролях было показано, что образцы без облучения, как и сам процесс облучения, не оказывали влияния на жизнеспособность исследуемых микроорганизмов. Данные результаты были подтверждены с помощью модифицированного метода стекающей капли, который относится к категории скрининговых исследований. После инкубации в термостате на траектории стекания бульонной культуры образовывался плотный рост бактериальной культуры, который прерывался на месте нанесения фотосенсибилизатора. Так, на рис. 2, а наглядно показано подавление роста бактериальных культур на участке нанесения ФМН с последующим облучением. Следует отметить, что бактериальные культуры, не подверженные воздействию препарата, сохраняли свою жизнеспособность.

Влияние фотодинамического воздействия производных рибофлавина на значения КОЕ/мл клинических изолятов и количество БОЕ/мл фага после облучения

Рис. 2. Подавление роста Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa при фотоактивации ФМН (а) и воздействие ФМН на колифаг (б).

Прерывание бактериальной дорожки на месте нанесения препарата свидетельствует об его антибактериальной активности (метод стекающей капли). На контрольной чашке (слева) видны бляшки (результат литического действия фага), а на опытном образце (справа) визуализируется только одна бляшка.

На примере бактериофага (колифага) были исследованы антивирусные свойства производных рибофлавина. Было показано, что после облучения в течение 1 ч, количество бляшкообразующих частиц (БОЕ) сократилось на 3 порядка, что демонстрирует эффективность использования производных рибофлавина в качестве антивирусного препарата. На рис. 2, б приведен пример одного типичного эксперимента, который наглядно показывает уменьшение числа бляшкообразующих единиц.

Заключение

Полученные результаты показали, что низкомолекулярный ФМН и высокомолекулярный конъюгат Рф-ПЭГ обладают антимикробной активностью по отношению как грамположительным, так и грамотрицательным микроорганизмам. Эффективность подавления микроорганизмов в условиях in vitro составила 4 порядка при концентрации фотосенсибилизатора 0,2 мг (для конъюгата выполнялся пересчет на активную часть молекулы) и дозе облучения 30 Дж/см². Модифицированным методом стекающей капли продемонстрировано ингибирующее воздействие деривативов Рф по отношению к Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa. Показана активность ФМН в отношении фаговых частиц, что демонстрирует перспективы применения производных Рф при антивирусной терапии. Использование соединений с разной молекулярной массой может обеспечить пролонгированное антибактериальное действие активного компонента в результате контролируемой диффузии аплицируемых на рану препаратов.

Финансирование. Работа выполнена при финансировании Министерства науки и высшего образования в рамках выполнения работ по Государственному заданию ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН в части исследования фотосенсибилизирующих свойств конъюгата рибофлавина и гранта РФФИ 20-04-60357 в части изучения антимикробной и антивирусной активности производных рибофлавина.

Конфликт интересов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.