Введение

Бактерии рода Lactobacillus широко распространены в природных экосистемах, в том числе входят в состав нормальной микрофлоры кишечника человека [1, 2]. Они также активно используются в получении пищевых продуктов и как пробиотики [1]. Как все молочнокислые бактерии (МКБ), лактобациллы имеют GRAS (Generally Regarded As Safe) статус, то есть считаются безопасными для животных и человека [2]. Однако в последние годы вопрос о безопасности МКБ неоднократно поднимался в мировой литературе в связи с их потенциальной способностью служить резервуаром генов устойчивости к антибиотикам и вектором для их распространения в природе [3]. Антибиотикорезистентность (АР) у МКБ бывает двух видов: врожденная (природная) и приобретенная (в том числе возникшая в результате мутаций). Первый тип устойчивости считается не подверженным горизонтальному транспорту и поэтому безопасным. Более того, при отборе пробиотических штаммов предпочтение отдается таким устойчивым бактериям, поскольку созданные на их основе препараты можно совмещать с антимикробной терапией. Второй вид устойчивости, как правило, возникает в результате горизонтального транспорта генов (ГТГ), детерминирован генами, локализованными на мобильных генетических элементах, и может передаваться от лактобацилл к другим бактериям. Так, у лактобацилл, выделенных из некоторых пищевых продуктов и пробиотиков, обнаружены приобретенные гены устойчивости, способные к горизонтальному транспорту in vitro и in vivo [4—8]. Экспериментально доказана передача гена устойчивости к тетрациклину tetM от лактобацилл к Enterococcus faecalis [3, 6, 8] и Lactoccocus lactis [3]. Наиболее распространенным механизмом передачи генов АР у лактобацилл является конъюгация, которая предполагает прямой контакт между клетками. Тем не менее ГТГ посредством трансформации, поглощения бактериальными клетками молекул ДНК из окружающей среды также возможен, особенно в местах с высокой плотностью микроорганизмов, как в желудочно-кишечном тракте человека и животных [9]. Благодаря плазмидным механизмам стабилизации многие гены АР достаточно долго сохраняются не только внутри бактериальных клеток, но и в окружающей среде, даже в отсутствие селективного давления антибиотика [4].

Данная работа выполнена с целью выяснить возможность передачи генетических детерминант устойчивости к антибиотикам от лактобацилл к грамотрицательным представителям кишечной микробиоты. В качестве объекта исследования был выбран промышленный штамм L. fermentum 5-1, поскольку ранее у него была обнаружена устойчивость к тетрациклину [10] — антибиотику, гены устойчивости к которому часто бывают мобильными [11]. Исследовав возможность транспорта генов АР в различных экспериментальных условиях, нам удалось зафиксировать передачу гена устойчивости к тетрациклину от лактобацилл к бактериям Citrobacter freundii в процессе трансформации с электропорацией. Полученный нами результат является свидетельством потенциального участия лактобацилл L. fermentum 5-1 в распространении АР — одной из основных проблем здравоохранения в мире.

Материал и методы

Микроорганизмы и условия культивирования. Объектом исследования являлся штамм Lactobacillus fermentum 5-1, выделенный из кисломолочного продукта Ряженка 4% (ОАО Чистое поле, г. Казань) и идентифицированный нами ранее [12]. Лактобациллы выращивали микроаэрофильно в жидкой и агаризованной среде MRS (De Man-Rogosa-Sharpe) (De Man и соавт., 1960) при 37 °C.

В качестве потенциальных реципиентов генетических детерминант АР использовали грамотрицательные бактерии: Acinetobacter baumannii, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumonia, Serratia marcescens G (Институт медицинской микробиологии, Гиссен, Германия), Serratia marcescens N, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Escherichia coli (ФБУН КНИИ «Институт эпидемиологии и микробиологии» Роспотребнадзора, Казань). Бактерии культивировали аэрофильно на питательной среде Лурия-Бертани (LB) [13] при 37 °C.

Методы оценки чувствительности бактерий к антибиотикам. Метод градиентного агара использовали для определения чувствительности грамотрицательных бактерий к эритромицину («Sigma-Aldrich») и тетрациклину («Sigma-Aldrich»). Ночную культуру тестируемых микроорганизмов высевали газоном на чашки с градиентом концентрации антибиотика от 0 до 100 мкг/мл и инкубировали при 37 °C в течение 24 ч, после чего определяли минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотика, при которой не наблюдалось видимого роста бактерий. Если ингибирование роста бактерий происходило при концентрации антибиотика менее 0,5 мкг/мл, то микроорганизмы считали чувствительными [14]. МПК антибиотиков определяли методом микроразведений в жидкой среде MRS в 96-луночных планшетах для культивирования клеток («Eppendorf») в диапазоне концентраций 0,12—256 мкг/мл, полученных после серии двукратных разведений. Планшеты засевали 200 мкл культуры бактерий (3·10⁷ КОЕ/мл) и инкубировали 24 ч при 37 °C, после чего определяли МПК антибиотика как минимальную концентрацию, при которой не наблюдалось видимого роста бактерий.

Определение антагонистической активности лактобацилл. Ночную культуру лактобацилл высевали «газоном» на MRS-агар и инкубировали 48 ч при 37 °C. Агаровые блоки с колониями лактобацилл вырезали стерильным пробочным сверлом и устанавливали в чашках Петри на поверхности агаризованной среды LB, засеянной 8—10-часовой культурой тест-микроорганизмов. О степени антагонистической активности судили через 24 ч инкубирования при 37 °C по диаметру зон задержки роста тест-микроорганизмов вокруг агаровых блоков с лактобациллами [15].

Выделение ДНК. Геномную ДНК исследуемых микроорганизмов выделяли фенол-хлороформным методом [20], плазмидную ДНК — с помощью GenJET Plasmid Miniprep Kit «Thermo Scientific» (Литва) в соответствии с инструкцией производителя.

ПЦР-анализ. Детекцию генов АР осуществляли с помощью ПЦР-анализа с использованием специфических праймеров, представленных в табл. 1. Реакционная смесь для ПЦР объемом 25 мкл содержала 0,03—0,04 мкг матричной ДНК, 10 пМ каждого праймера (см. табл. 1), 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 20 мм Tris-HCl (pH 8.8), 10 мм KCl, 10 мм (NH4)2SO4, 2 мм MgSO4, 0,1% Triton X-100 и 1,0 единицу Taq-полимеразы. ПЦР проводили с помощью термоциклера «С1000 Thermal Cycler» («Bio-Rad», США): начальная денатурация ДНК при 95 °C в течение 5 мин, далее 35 циклов: 94 °C — 30 с, отжиг олигонуклеотидов — 30 с (в соответствии с температурой отжига для отдельных праймеров, см. табл. 1), 72 °C с учетом времени из расчета 1000 нуклеотидов в мин, финальная элонгация 72 °C в течение 7 мин. ПЦР-продукты разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле, окрашенным Midori Green DNA Strain («Nippon Genetics Europe», Германия), с последующей визуализацией на «Gel Doc XR+» («Bio-Rad», США).

Таблица 1. Синтетические олигонуклеотиды, использованные в работе

Секвенирование ДНК проводили на оборудовании Междисциплинарного центра коллективного пользования КФУ для обеспечения клеточных, геномных и постгеномных исследований в Приволжском регионе методом Сэнгера на секвенаторе ABI Prism 3730 (Applied Biosystems). Анализ первичных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы BLASTn (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).

Совместное культивирование лактобацилл и бактерий-реципиентов в условиях, имитирующих содержимое кишечника. Лактобациллы и клетки реципиентных бактерий, выращенные до стационарной стадии роста, отмывали от питательной среды центрифугированием и смешивали в соотношении 1:1 в буфере, имитирующем содержимое толстого кишечника человека (г/л: KCl — 0.2, NaCl — 8, KH2PO4 — 0,24, Na2HPO4 — 1,44, pH 7,0) [16]. Полученную суспензию клеток с плотностью 109 КОЕ/мл инкубировали на качалке при 37 °C в течение 8 ч, после чего 500 мкл высевали поверхностно на LB-агар с 10 мкг/мл тетрациклина («Sigma-Aldrich»). В контрольном варианте смесь бактерий высевали на чашки с LB-агаром и MRS-агаром без антибиотика. Чашки инкубировали в течение 24 ч при 37 °C.

«Конъюгацию на мембране» проводили как описано ранее [3]. В качестве реципиентов использовали чувствительные к тетрациклину штаммы A. baumannii, E. coli и C. freundii. Для эксперимента свежие среды MRS и LB инокулировали в соотношении 1:100 ночными культурами лактобацилл и реципиентными бактериями, соответственно, и инкубировали при 37 °C 4—5 ч до достижения середины экспоненциальной фазы роста. Равные объемы (по 1 мл каждого) донорных и реципиентных бактерий смешивали и фильтровали через стерильный нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм (Millipore, США). После этого через фильтр пропускали стерильный физиологический солевой раствор пептона (PPS) (г/л: NaCl — 8,5; бактериологический пептон — 1) для более плотного спаивания клеток на мембране. Фильтры инкубировали в течение ночи на LB-агаре при 37 °C, после чего смывали бактерии с мембран 2 мл PPS и высевали на двойной селективный LB-агар, содержащий 10 мг/мл тетрациклина и экспериментально отобранный нами селективный антибиотик. Для трансконъюгантов A. baumannii в качестве селективного антибиотика использовали хлорамфеникол (40 мкг/мл), для E. coli — рифампицин (2,5 мкг/мл), для C. freundii — ампициллин (40 мкг/мл). Донорные и реципиентные культуры также высевали на агар с антибиотиками в качестве контроля. Чашки инкубировали при 37 °C в течение 24 ч.

Трансформация бактерий методом электропорации. Компетентные клетки реципиентных бактерий были получены как описано ранее [13]. Электропорацию реципиентных клеток (50 мкл, 1010 кл/мл) проводили с использованием 3 мкл плазмидной ДНК лактобацилл в 1 мм стерильных электропорационных кюветах («Cell Projects», Великобритания) на электропораторе MicroPulser («Bio-Rad») при напряжении 2,5 кВ и длительности импульса 5 мс. Затем содержимое кювет смешивали с 1 мл среды LB и инкубировали аэробно 1 ч при 37 °C, после чего 350 мкл высевали поверхностно на LB-агар с 10 мкг/мл тетрациклина и инкубировали 24 ч при 37 °C.

Результаты и обсуждение

В данной работе исследована передача генов АР от L. fermentum 5-1 к грамотрицательной гастроинтестинальной микрофлоре в процессе конъюгации и трансформации, а также при совместном культивировании в условиях, имитирующих среду кишечника. Данный штамм выбран нами для исследования, поскольку ранее диско-диффузионным методом мы показали, что он обладает профилем АР, нетипичным для представителей рода Lactobacillus. А именно в отличие от большинства лактобацилл он был чувствителен к ванкомицину и цефотаксиму и устойчив к эритромицину [10]. В данной работе мы более точно охарактеризовали профиль АР L. fermentum 5-1, определив МПК антибиотиков (табл. 2) и проверив наличие соответствующих геномных детерминант АР.

Таблица 2. Устойчивость штамма Lactobacillus fermentum 5-1 к антибактериальным препаратам

Примечание. а — Отношение к антибиотику, определенное нами ранее [10] диско-диффузионным методом: S — чувствительный, I — промежуточный, R — устойчивый. * — Эпидемиологические точки отсечения не установлены.

МПК антибиотика выше эпидемиологической точки отсечения позволяет отнести штамм к устойчивым к данному антибиотику [22]. При этом эпидемиологические точки отсечения для многих антибиотиков не установлены (см. табл. 2). Кроме того, МПК одного и того же антибиотика отличаются для разных видов лактобацилл и зависят от условий культивирования [21].

Сравнив полученные МПК с известными эпидемиологическими точками отсечения для вида L. fermentum, установили, что исследуемый штамм, как большинство лактобацилл, чувствителен к ампициллину и устойчив к аминогликозидам (см. табл. 2). Устойчивость лактобацилл к аминогликозидным антибиотикам, как правило, связана с низкой проницаемостью мембраны лактобацилл для препаратов этой группы и не детерминирована генетически [4]. Действительно, в геноме L. fermentum 5-1 не были обнаружены гены устойчивости к аминогликозидам aph(3’)-III, aadA и aadE, отвечающие за модификацию молекулы антибиотика.

Устойчивость к ванкомицину и ципрофлоксацину также широко распространена среди лактобацилл. Поскольку она считается природной [4], эпидемиологические точки отсечения для этих антибиотиков не установлены. Однако высокие МПК позволяют считать бактерии L. fermentum 5-1 устойчивыми к ванкомицину и ципрофлоксацину. Ранее штамм L. fermentum 5-1 был ошибочно определен как чувствительный к ванкомицину [10], что можно объяснить низкой точностью диско-диффузионного метода оценки АР. Штамм L. fermentum 5-1 чувствителен к рифампицину и цефотаксиму, на что указывают низкие МПК этих антибиотиков и результаты, полученные диско-диффузионным методом (см. табл. 2).

Наибольшее значение имеет устойчивость лактобацилл к эритромицину, тетрациклину и хлорамфениколу, поскольку гены устойчивости к данным антибиотикам часто мобильны [11]. На основании полученных значений МПК мы установили, что исследуемый штамм L. fermentum 5-1 обладает промежуточной (низкой) устойчивостью к эритромицину (МПК=1 мкг/мл) и тетрациклину (МПК=8 мкг/мл) и устойчив к хлорамфениколу (МПК=8 мкг/мл). С помощью ПЦР-анализа и последующего секвенирования полученного ампликона в хромосомной ДНК L. fermentum 5-1 мы обнаружили ген устойчивости к эритромицину ermB, на 96% гомологичный гену 23S рРНК метилазы Enterococcus faecium, Streptococcus pneumoniae и Staphylococcus aureus. В плазмидной ДНК L. fermentum 5-1 детектировали два гена устойчивости к тетрациклину — tetM и tetK. Гены ermA, ermC, ermT, mefA, mefE, tetL, tetS, tetW, а также ген устойчивости к хлорамфениколу cat не выявлены. У L. fermentum 5-1 также не обнаружены последовательности int и int-tetM, ассоциированные с конъюгативным транспозоном Tn916, который, по данным литературы, способствует распространению гена tetM от лактобацилл к другим бактериям [4, 8].

Промежуточная (низкая) устойчивость к антибиотикам у лактобацилл, как правило, является природной, кодируется хромосомными генами и, как следствие, не склонна к распространению в микробиоме [23]. Однако у штамма L. fermentum 5-1 с промежуточной устойчивостью к тетрациклину мы обнаружили два плазмидных гена устойчивости tetM и tetK. Поэтому далее мы проверили возможность их передачи другим бактериям. В качестве реципиентов выбрали бактерии A. baumannii, C. freundii и E. coli, у которых мы экспериментально подтвердили отсутствие фенотипической и генотипической устойчивости к тетрациклину (рис. 1, а). Эти бактерии соседствуют с лактобациллами в кишечной эконише и обладают определенным патогенетическим потенциалом. Штаммы A. baumannii с множественной лекарственной устойчивостью считаются сегодня одними из самых опасных возбудителей нозокомиальных инфекций [24]. C. freundii является оппортунистическим патогеном, способным вызывать широкий спектр поражений: неонатальный менингит, инфекции мочевыводящих путей, бактериемии, пневмонии, остеомиелиты, гнойные осложнения хирургических ран и др. [25]. Факторы вирулентности этого микроорганизма пока слабо изучены — по-видимому, они сходны с таковыми других условно-патогенных представителей семейства Enterobacteriaceae, в частности, вирулентных штаммов E. coli. Последние чаще всего вызывают диареи, инфекции мочевыводящих путей, бактериемии и менингиты [26].

Рис. 1. Характеристика грамотрицательных бактерий, использованных в качестве потенциальных реципиентов генов антибиотикорезистентности лактобацилл.

а — минимальные подавляющие концентрации (МПК) тетрациклина (мкг/мл), определенные методом градиентного агара; б — чувствительность реципиентных бактерий к антагонистической активности лактобацилл L. fermentum 5-1, определенная методом агаровых блоков. Цифрой указаны размеры зон ингибирования роста реципиентных бактерий (мм).

В качестве модельного микроорганизма-реципиента генов устойчивости от МКБ, как правило, используют Enterococcus faecalis [3, 6, 8], тогда как исследования, выполненные на грамотрицательных бактериях-реципиентах, практически не описаны в литературе. Тем не менее известно, что филогенетически далекие друг от друга микроорганизмы в естественных эконишах могут обмениваться генами лекарственной устойчивости посредством трансформации [27]. Кроме того, возможен конъюгативный перенос генетических детерминант АР между грамположительными и грамотрицательными бактериями [28].

Вначале мы исследовали возможность приобретения бактериями C. freundii, A. baumannii и E. coli устойчивости к тетрациклину в ходе совместного культивирования с лактобациллами в условиях, имитирующих среду кишечника. По окончании времени совместной инкубации смесь бактерий доноров и реципиентов высевали на питательную среду с тетрациклином. В случае приобретения генетических детерминант устойчивости к тетрациклину реципиентные клетки становятся способны расти на предложенной среде, но на ней вырастали только колонии L. fermentum 5-1. Чтобы исключить гибель бактерий-реципиентов в результате известной высокой антагонистической активности лактобацилл [29], мы исследовали способность L. fermentum 5-1 подавлять рост бактерий C. freundii, A. baumannii и E. coli и установили, что все тест-микроорганизмы проявляют чувствительность бактерицидным веществам, выделяемым лактобациллами, но полного подавления их роста не происходит (рис. 1, б). Таким образом, результаты проведенного исследования мобильности генов АР лактобацилл указывают на то, что в ходе совместного культивирования не происходила передача генетических детерминант устойчивости к тетрациклину от L. fermentum 5-1 к исследованным представителям кишечной микробиоты.

Основным механизмом горизонтального переноса генов АР в природе считается конъюгация [28]. В эксперименте «конъюгация на мембране» лактобациллы передавали гены tetM и ermB бактериям Enterococcus faecalis [3, 5—8]. В естественных условиях желудочно-кишечного тракта передача плазмид, несущих гены tetM и ermB, от лактобацилл к Enterococcus faecalis происходила даже более эффективно, чем in vitro [5, 6]. Тем не менее в проведенном нами эксперименте «конъюгации на мембране» не происходила передача устойчивости к тетрациклину от L. fermentum 5-1 к C. freundii, A. baumannii и E. coli, о чем свидетельствует отсутствие роста на чашках с двойной селективной средой.

Далее мы проверили возможность передачи генов устойчивости к тетрациклину в процессе трансформации. На важную роль процесса трансформации в распространении АР указывают последние данные о количественном преобладании внеклеточной ДНК над внутриклеточной в природных эконишах [30]. Поскольку точно неизвестно, какие факторы в природе инициируют переход клеток в состояние компетентности, реципиентные бактерии были подвергнуты электропорации. Проведенная после этого трансформация плазмидной ДНК L. fermentum 5-1 привела к появлению у C. freundii устойчивости к тетрациклину (рис. 2, а). Из бактерий-трансформантов, выросших на селективной среде с тетрациклином, была выделена ДНК и в ней методом ПЦР детектирован ген tetK размером 278 п.о. (рис. 2, б).

Рис. 2. Передача гена устойчивости к тетрациклину tetk, находящегося в плазмидной ДНК Lactobacillus fermentum 5-1, бактериям Citrobacter freundii в процессе трансформации с электропорацией.

а — электрофорез ПЦР-продуктов амплификации гена tetk в геномной ДНК нативных клеток C. freundii демонстрирует отсутствие целевого гена; б — детекция гена tetK в геномной ДНК клеток C. freundii, трансформированных плазмидной ДНК L. fermentum 5-1. Дорожки 1-5 — геномная ДНК отдельных колоний-трансформантов C. freundii; в — рост трансформантов C. freundii на среде с тетрациклином после электропорации с использованием плазмидной ДНК L. fermentum 5-1.

Заключение

Таким образом, в данной работе мы показали, что промежуточно устойчивые к тетрациклину бактерии L. fermentum 5-1, несущие гены устойчивости tetM и tetK на плазмидной ДНК, могут служить потенциальными векторами накопления и распространения генов АР в кишечном микробиоме. Практическое применение таких штаммов МКБ в пищевой отрасли и в пробиотикотерапии недопустимо, поскольку является опасным с позиций распространения устойчивости к антимикробным препаратам, что, по современным оценкам, представляет собой одну из самых серьезных угроз глобальной национальной безопасности [4].

Финансирование. Работа выполнена в рамках Программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета с использованием оборудования Междисциплинарного центра коллективного пользования КФУ и финансированием за счет средств РФФИ (18-34-00268, 17-00-00456).

Соблюдение этических стандартов. Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.