Диапазон температур, в пределах которого способны размножаться вирусы гриппа, — 25—41 °С. В естественных условиях вирусы гриппа человека реплицируются в верхних дыхательных путях (33—35 °С), вирусы гриппа птиц — в кишечнике (41 °С) [1]. В лаборатории оценивается способность вирусов гриппа к росту в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) и клеточной культуре. Вирусы, способные к эффективному размножению при температуре 25 °C, считают холодоадаптированными (ХА, са, от «cold-adapted»). Вирусы, репликация которых значительно снижена при температурах выше температурного оптимума, — чувствительными к повышенной температуре (ts, от «temperature sensitive»). Устойчивое сочетание свойств холодоадаптированности и чувствительности к повышенной температуре инкубации позволяет достичь аттенуации вируса для человека, что является основой для подготовки живых холодоадаптированных противогриппозных вакцин (ЖГВ).

На настоящий момент вакцины получают на основе доноров аттенуации — ХА вирусов устаревшей антигенной структуры, обладающих полностью охарактеризованным геномом, безопасность использования которых доказана многолетними клиническими испытаниями [2, 3]. При подготовке живой реассортантной гриппозной вакцины гемагглютинин (HA) и нейраминидаза (NA) донора аттенуации заменяются на НА и NA эпидемического штамма, что необходимо для формирования иммунного ответа к актуальному вирусу, а внутренние гены, содержащие генетические детерминанты аттенуации, принадлежат ХА вирусу. Большой интерес представляют собой исследования молекулярных основ свойств температурочувствительности и холодовой адаптации у вирусов гриппа. Знания о том, как регулируется фенотип вируса, позволяют применять новые подходы к созданию противогриппозных вакцин, повышать их эффективность, сохраняя при этом показатели безопасности.

Опубликован ряд исследований, посвященных анализу генома ХА штаммов гриппа В, влиянию отдельных генов на фенотип, а также вкладу отдельных мутаций. На основании этих исследований мы провели анализ расположения аминокислотных позиций, уникальные замены в которых характерны для ХА вирусов гриппа В, в попытке понять, какие физические явления лежат в основе аттенуации вирусов гриппа В.

Существует ряд аттенуированных ХА штаммов вируса гриппа В, описанных разными исследователями. Для подготовки коммерческой ЖГВ в США используется ХА вирус B/Ann Arbor/1/66са (донор аттенуации вакцины FluMist) [4]; донор аттенуации отечественной ЖГВ — В/СССР/60/69 [2, 5]. Еще несколько штаммов охарактеризовано в качестве потенциальных доноров аттенуации для подготовки вакцин (табл. 1).

Штамм В/АА был получен путем пассирования вируса гриппа B/Ann Arbor/1/66 при понижающейся температуре в РКЭ и первичной культуре куриных фибробластов [13]. В геноме ХА штамма обнаружено 9 уникальных аминокислотных замен, из них 7 в белках рибонуклеопротеинового комплекса (табл. 2).

Донор аттенуации отечественной коммерческой ЖГВ В60 был получен на основе штамма B/СССР/17/69 — ts-варианта «дикого» вируса, прошедшего 17 пассажей в РКЭ при 32 °C [15]. Поиск аминокислотных замен в белках донора аттенуации В60 выявил изменения в PB2, PA, M1, BM2 и NS1 [5]. Две из обнаруженных замен (одна в PB2, одна в BM2) являются неуникальными. Исследование одногенных реассортантов донора аттенуации В60 с эпидемическими вирусами показало важнейшую роль в аттенуации генов PA и PB2 [5].

ХА вирус B/Ленинград/14/17/55 — перспективный резервный донор аттенуации ЖГВ, был подготовлен в отделе вирусологии Института экспериментальной медицины (ФГБНУ ИЭМ). При подготовке прошел 17 пассажей при пониженной температуре. Анализ фенотипических характеристик В14 выявил стабильность и значительную выраженность ХА и ts фенотипов, а также аттенуированность В14 и штаммов на его основе в экспериментах на животных. После клинических испытаний штамм был охарактеризован как безвредный, ареактогенный и высокоиммуногенный [7, 16]. Мы провели секвенирование генома В14 и последующее сравнение последовательностей генетических сегментов и соответствующих аминокислотных последовательностей белков с последовательностями вирусов гриппа В разных лет выделения, в результате чего было выявлено 17 уникальных аминокислотных замен, а также одна не уникальная замена в ВМ2 (табл. 3).

ХА штамм В/Виктория/2/63/87 был получен пассированием вируса В/Виктория/2/87 в РКЭ и культуре клеток MDCK при понижающейся температуре [8]. Первый ts-вариант, полученный авторами, был недостаточно ХА, и не был аттенуирован для мышей, поэтому вирус был подвергнут дальнейшему пассированию и получен вариант В/Виктория/2/63/87. В последовательности генома были выявлены уникальные среди вирусов гриппа В мутации (см. табл. 3). Штамм, обладающий выраженным ХА фенотипом, приобрел только 2 дополнительные мутации по сравнению с первым вариантом — в сегментах, кодирующих РА и М, из них одна привела к аминокислотной замене (I625V в PA), что говорит о ее исключительной роли в формировании ХА и аттенуированного фенотипа данного вируса. Исследований раздельного влияния остальных мутаций в работе не приводится [8].

ХА штаммы BV22 и BV37 получены серийным пассированием вируса B/Vienna/1/99 при 25 °C в клеточной культуре Vero/SF [9]. Штамм BV22 прошел 22 пассажа, вариант BV37 был получен дальнейшим пассированием и в общей сложности прошел 37 пассажей. Были показаны ХА, ts фенотипы штамма BV22, а также его аттенуация для мышей, в клинических испытаниях штамма BV22 с участием 13 волонтеров показаны безопасность и иммуногенность штамма [9]. Исследования штамма BV37, прошедшего дополнительные пассажи при низкой температуре, не опубликованы, в связи с чем говорить о доказанном влиянии двух дополнительных аминокислотных замен (P51L в NP и I87L в BM2) на холодовую адаптацию и аттенуацию необоснованно.

В литературе также описан ХА вариант вируса B/Lee/40, полученный путем длительного пассирования при пониженной температуре (79 пассажей) и обладающий аттенуированным фенотипом. Исходный штамм, использованный для получения ХА варианта, являлся в незначительной степени аттенуированным для мышей, что связывают с большим количеством пассажей в разных субстратах и, как следствие, накоплением точечных мутаций в разных генах (авторы пишут о 61 точечной мутации в использованном ими «диком» штамме). К сожалению, ни одна из работ, посвященных ХА штамму вируса В/Lee/40 и реассортантам на его основе [10—12], не содержит информации о последовательности его генома или влиянии отдельных генетических сегментов на аттенуацию.

В табл. 3 приведен список нуклеотидных и аминокислотных замен, обнаруженных у разных ХА штаммов. Часть замен описана авторами ХА штаммов при сравнении геномов ХА вариантов с эпидемическими предшественниками, часть замен является уникальной среди вирусов гриппа В разных лет выделения. Мы провели анализ встречаемости данных замен среди вирусов гриппа В, в который были включены не идентичные последовательности полноразмерных сегментов генома и белков вирусов гриппа В, выделенных до 2016 г., представленные в базе данных Influenza Research Database (fludb.org).

Белки полимеразного комплекса (PB1, PB2, PA)

РНК-зависимая РНК-полимераза вируса гриппа — гетеротримерный белок, состоящий из трех субъединиц PB1, PB2 и PA. Уникальные замены обнаружены во всех белках полимеразного комплекса ХА вирусов и являются важнейшими детерминантами ts/ca фенотипа ХА вирусов, что неоднократно показано для разных доноров аттенуации [4, 5, 8].

Тримеры РНК-зависимой РНК-полимеразы входят в состав вирусной частицы в составе рибонуклеопротеиновых (РНП) комплексов. В структуре РНП-комплекса консервативные 5’- и 3’-концы сегментов однонитевой РНК вируса гриппа связаны с полимеразой, оставшаяся часть РНК упакована с помощью нуклеопротеина (NP). Вирусная полимераза обеспечивает осуществление транскрипции вирусных мРНК и репликации новых вирусных РНК [17].

Полимеразный комплекс имеет U-образную структуру, выступающие части сформированы N-терминальным доменом субъединицы РА и кэп-связывающим доменом субъединицы РВ2, между которыми располагается канал, по которому проходит РНК. Основание структуры сформировано крупным доменом РА-С и С-концевой частью РВ2. «Тело» полимеразы сформировано субъединицей РВ1, с одной стороны окруженной N-концевой третью РВ2, с другой — РА-линкером, соединяющим эндонуклеазный домен субъединицы РА (PA-N) с РА-С [18].

Субъединица РВ1 содержит большое количество высококонсервативных доменов, осуществляющих полимеризацию, изменения в которых могут привести к потере полимеразой основной функции. N- и C-концевые области PB1 формируют участки взаимодействия с PB2 и PA, остальные домены задействованы в процессе полимеризации: это полимеразные «пальцы», домены «большой палец» и «ладонь» полимеразы [19]. Участок 177−214 (здесь и далее курсивными цифрами обозначены номера аминокислотных остатков) PB1 формирует длинный β-ленточный участок, имеющий участки связывания с РНК и NP и задействованный в процессе транслокации РНК в активный центр фермента. Аминокислотные остатки 670−679 PB1 вовлечены в связывание с 3’-концом РНК, 5’-конец взаимодействует с β-шпилечной структурой PB1 и петлей 368−395 PA. Участок 640−657 PB1 формирует специальную «праймирующую» петлю, стабилизирующую структуру РНК в начале синтеза. Кончик петли содержит A-H-G-P-мотив, консервативный у всех полимераз вируса гриппа, в непосредственное взаимодействие с нуклеотидами вступает His [19].

В области полимеразных «пальцев» локализованы замены D120G у B/Вик/63 и E75K у B14 (рис. 1, а),

При анализе последовательностей ХА вирусов в представленной в базе данных последовательности ХА штамма В/АА (GenBank# M20169.1, AAA43769.1) в домене РВ1 была обнаружена уникальная среди вирусов гриппа В замена S664D, расположенная в области «большого пальца» полимеразы на линкерном участке, также в высококонсервативной области. Однако авторами штамма было показано, что генетический сегмент РВ1 ХА вируса В/АА не влияет на фенотипические характеристики этого вируса [14], и в исследовании роли уникальных мутаций в геноме донора В/АА не упоминаются замены в сегменте РВ1 [4, 6].

Субъединица PB2 полимеразного комплекса играет структурообразующую роль и вовлечена в процессы взаимодействия с клеточными факторами.

N-концевой домен PB2 (1−247) состоит из нескольких субдоменов, окружающих субъединицу РВ1. Самое начало PB2 взаимодействует с С-концевой частью РВ1, в данном участке содержит замену донор аттенуации В14 (T20P), возможно, компенсирующую замену в С-концевой части РВ1 (D737G). Остатки 35−52 PB2 находятся в растянутой конформации, за ними расположена α₄-спираль, взаимодействующая с матрицей в момент прохождения той по направлению к активному центру полимеразы. Далее расположен субдомен N1, тесно взаимодействующий с «большим пальцем» полимеразы (55−103). В данном домене у B14 располагаются замены T62I и K124R. В составе субдомена N2 (110−247) выделяют подвижную структуру, перекрывающую выход из активного центра фермента: она смещается в момент перемещения праймирующей петли и изменения конформации большого пальца полимеразы при осуществлении элонгации, открывая канал для выхода продукта [19]. В данном домене расположены аминокислотные замены R185K у B/Вик/63 и P158Q у B14 (см. рис. 1, б).

С-концевая часть РВ2 включает mid-домен, подвижный кэп-связывающий домен, 627-домен, присоединенный протяженным линкером, и сигнал ядерной локализации на С-конце РВ2. В mid-домене расположены аминокислотные замены у вирусов B14 (I303M) и В60. По данным A. Pflug и соавт. [20], участок белка, в котором расположена замена у донора аттенуации В60, задействован в белок-белковых взаимодействиях.

Кэп-связывающий домен наряду с эндонуклеазным доменом РА вовлечен в захват кэпированных олигомеров клетки-хозяина в ходе транскрипции [19]. Кэп отщепляется эндонуклеазным доменом РА и используется для начала синтеза вирусной мРНК субъединицей PB1. Замедление полимеразы на участке олиго-U возле 5’-конца ведет к авто-полиаденилированию. Таким образом, готовые к трансляции вирусные мРНК синтезируются без участия вирусных кэпирующих белков, а также полиаденилирующих ферментов хозяина, которые инактивируются белком NS1, чтобы остановить трансляцию белков клетки-хозяина [18]. В кэп-связывающем домене располагаются замены у доноров аттенуации В60 и В14 (E467G). По данным S. Reich и соавт. [19], аминокислотные остатки 466−467 формируют поворот полипептидной цепи между β19 и β20.

627-домен РВ2 вирусов гриппа связан со специфичностью вируса к хозяину и температурочувствительностью [21]. 627-й аминокислотный остаток отличается у вирусов гриппа, выделенных от разных животных, у человеческих изолятов гриппа, А и В — это остаток лизина [22]. У вирусов гриппа, А описан ряд аминокислотных остатков, отвечающих за специфичность к хозяину, расположенных в данном домене, в основном они локализованы на поверхности и вовлечены во взаимодействие с клеточными белками. Также этот домен вовлечен во взаимодействие РНК-полимеразы с нуклеопротеином [23]. В этом домене располагается не уникальная замена у донора аттенуации В60, возникшая после холодового пассирования, а также аминокислотная замена S630R В/АА (см. рис. 1, б). По данным S. Reich и соавт. [19], аминокислоты 630 и 631 у вирусов гриппа В формируют поворот полипептидной цепи между α₂₇η₄ и β₂₇.

Субъединица РА состоит из двух доменов, расположенных по разные стороны полимеразного комплекса и соединенных длинным линкером (194−252), пролегающим вокруг полимеразных «пальцев» и «ладони». На N-конце РА располагается эндонуклеазный домен (1−193), по другую сторону комплекса расположен обширный домен PA-C (252−726). Междоменный линкер, проходя по поверхности PB1, формирует ряд межсубъединичных контактов (см. рис. 1, в).

Эндонуклеазный домен заякорен в структуре комплекса посредством контактов со спиральным регионом PB1-C. Замена в эндонуклеазном домене у вируса В60 расположена в высококонсервативном участке в β₆-листе, перед поворотом полипептидной цепи. Замена I191R у В14, радикальная по характеру, располагается в α₇, в непосредственной близости от междоменного линкера. На рис. 1, в можно рассмотреть, что данный аминокислотный остаток располагается близко к внешней поверхности эндонуклеазного домена. Непосредственно в линкерном участке располагается еще одна замена у В14 — K236R, лизин в данной позиции встречается у некоторых вирусов 1993—1996 гг. выделения (см. табл. 4).

С-концевой домен субъединицы РА вступает в тесное взаимодействие с N-концевым фрагментом PB1. Взаимодействие доменов в данном участке является крайне важным для сборки и функционирования полимеразного комплекса, исследователями вирусов гриппа, А описаны множественные межсубъединичные контакты, нарушение которых ведет к снижению или полной утрате полимеразной активности [24, 25]. Структурное соответствие белков полимеразного комплекса у вирусов гриппа, А и В является высоким, в частности, в данном участке общая структура взаимодействующих частей субъединиц полимеразного комплекса гриппа В очень похожа на описанную для гриппа, А [19].

В С-концевом домене субъединицы РА расположено абсолютное большинство замен, если суммировать данные по всем ХА вирусам (см. рис. 1, г): 2 замены у B/AA (V431M, Y497H), 2 замены у В60, 3 замены у В14 (V538I, T614A, G673N), а также замена V625I у B/Вик/63. Видимо, изменение структуры С-концевой части белка PA способно значительно повлиять на температурный оптимум работы полимеразы, возможно, разрушая взаимодействие субъединиц при повышенной температуре. Это подтверждается данными исследований влияния одиночных замен на ts и ХА фенотип вирусов гриппа В — показана ключевая роль PA в аттенуации вируса В60 [5], связь ts фенотипа вируса В/АА с заменой V431M [4, 6], приобретение ХА фенотипа вирусом В/Вик/63 одновременно с появлением замены V625I [8].

Замена V431M В/АА располагается в участке РА, обращенном к субъединицам PB2 и PB1. Вторая замена у В/АА (Y497H) локализована в одном из нескольких β-листов, составляющих основу структуры PA-С домена, в той же области обнаружены замены у В14 (V538I) и В60. Вторая замена у В60 локализована в области, соседствующей с «полимеразными пальцами» PB1, в консервативном участке последовательности. В двух β-листах, вступающих в непосредственное взаимодействие в PB1 [24, 25], расположены замены V625I В/Вик/63 и G673N B14 (см. рис. 1, г). Ключевая роль замены V625I для ХА фенотипа В/Вик/63 показана авторами штамма [8], хотя замена не является уникальной: последовательности РА вирусов гриппа В с валином в 625-й позиции в незначительном количестве присутствуют в базе данных (см. табл. 3). Аспарагин в 673-й позиции у B14 располагается в области, расположенной недалеко от «ладони» полимеразы. У основной массы вирусов гриппа В в данной позиции находится глицин, также встречается серин.

Нуклеопротеин (NP) связывается с РНК вируса гриппа, обеспечивает ее упаковку в РНП-комплекс, взаимодействует с полимеразным комплексом и вовлечен в процессы транскрипции и репликации. NP состоит из двух доменов — головки и тела белка, преимущественно сложенных альфа-спиральными участками. Полипептидная цепь несколько раз проходит туда и обратно между двумя доменами, ограничивая возможности их движения между собой [26]. NP, как и РА, оказался наиболее подвержен изменениям у рассматриваемых ХА-вирусов. Была показана роль одиночных замен в NP вируса В/АА для проявления ts и ХА фенотипов [4, 6].

Гибкий участок из 71 аминокислотного остатка на N-конце белка задействован в процессах транскрипции и репликации [27]. Остатки 1−15 обеспечивают защиту всего участка от протеолитического действия ферментов клетки, остатки 44−47 представляют собой сигнал ядерной локализации [28]. Кроме ключевых аминокислот, роль в поддержании жизнеспособности вируса играет общая длина участка — исследование мутантов с продолжительными делециями на N-конце выявило пропорциональное длине делеции сокращение способности NP к олигомеризации. Предполагается, что в процессе олигомеризации удлиненный гибкий N-концевой участок взаимодействует с соседней молекулой NP, стабилизируя весь комплекс. В данном участке молекулы NP обнаружены изменения у четырех ХА вирусов: BV22 (S23F), BV37 (S23 °F и P51L), В/Вик/63 (P40S), B/AA (T55A).

Головка и тело NP соединяются посредством нескольких петлевых участков, между доменами располагается полость, сформированная двумя кластерами положительно заряженных аминокислотных остатков, — G1 (K125, K126, R235, R236) и G2 (R211, K213, R217). В этом участке происходит взаимодействие с РНК, замены приводят к неспособности NP присоединять РНК и обеспечивать взаимодействие с полимеразой [26].

Олигомеры белка проявляют значительно большую аффинность к молекулам РНК, чем очищенные мономеры. Аминокислотные остатки 459-486 формируют длинную хвостовую петлю, при гомоолигомеризации проникающую глубоко в полость, расположенную в теле соседней молекулы NP. Удаление петли приводит к невозможности олигомеризации, и как следствие, отсутствию полимеразной активности. Ключевые взаимодействия между аминокислотными остатками разных молекул NP, нарушение которых приводит к снижению эффективности олигомеризации, описаны в работе A. Ng и соавт. [26]. Одиночные мутации в данном регионе не оказывают критического влияния на жизнеспособность вируса, но при полной замене одного из кластеров полимеризация прекращается.

Участок 125−149 формирует высокогибкую петлю, принимающую участие в связывании с РНК. Замены положительно заряженных аминокислот, расположенных в данной области, на нейтральные, или отрицательно заряженные, приводят к снижению полимеразной активности — даже значительнее, чем полное удаление петли. Возможно, это связано с влиянием кислых аминокислотных остатков, влияющих на общий заряд участка. Ключевыми положительно заряженными остатками, расположенными в данной петле, являются остатки лизина 125, 126, 131, 132, 133. У донора аттенуации В14 в данном участке обнаружена замена I145V, замена такого характера не влияет на распределение заряда.

В головке NP располагаются замены V242G у В14 и A509T у B/AA (рис. 2, a),

Белки ВМ1 и ВМ2 кодируются 7-м сегментом генома вируса гриппа В. Экспрессия регулируется с помощью пентануклеотидного механизма стоп-старт регуляции [29].

Матриксный белок (BM1) играет важнейшую роль в репликации вируса, взаимодействуя с рядом факторов хозяйского и клеточного происхождения: обеспечивает нуклео-цитоплазматический экспорт РНП, играет роль в сборке и отпочковывании вирионов за счет взаимодействия с РНП, мембраной хозяйской клетки и цитоплазматическими участками вирусных гликопротеинов на плазматической мембране.

Структура белка BM1 экспериментально не установлена. В связи с тем что белок ВМ1 имеет только 30% сходство последовательности с М1 вируса гриппа А, делать выводы о расположении и функциональной роли отдельных аминокислотных остатков ВМ1 на основе данных о структуре М1 вирусов гриппа А, установленной экспериментально, можно только в порядке предположений.

Точно установлены функции отдельных участков ВМ1: замена N221S приводит к адаптации вируса к мышам [30], участки 3−14 и 134−124 — сигналы ядерного экспорта, 76−94 участок — сигнал ядерной локализации [31].

Нами была построена модель BM1 на основе первичной последовательности ВМ1 вируса гриппа B методом гомологичного моделирования [32]. По данным биоинформатического анализа, наиболее близкой структурой является матриксный белок вируса гриппа A/PR/8/34 (PDBID: 5CQE). Похожая модель представлена в исследовании [33]: в данной модели положительно и отрицательно заряженные аминокислотные остатки локализуются на разных сторонах молекулы матриксного белка (как и у вирусов гриппа А), обеспечивая олигомеризацию матриксного белка [30], а также взаимодействие ВМ1 и ВМ2 [33]. У вирусаВ/Вик/63 произошла замена E23K В ВМ1 (см. рис. 2, б). Остаток глутаминовой кислоты в позиции 23 консервативен у вирусов гриппа, А и В и принимает участие в формировании отрицательно заряженной поверхности матриксного белка вирусов гриппа, А [30]. Предположительно замена E23K должна значительно повлиять на распределение заряда в данной области за счет замены функционально важного отрицательно заряженного аминокислотного остатка на положительно заряженный.

В самом конце N-концевого участка белка, модель которого удается построить по гомологии, расположен остаток 159, в котором произошла замена H159Q у вирусаB/AA (см. рис. 2, б). Остаток гистидина в данной позиции является консервативным среди вирусов гриппа, А и В и частью мотива «цинковые пальцы» [34], связанного с взаимодействием с РНК. Замена H159Q у В/АА приводит к нарушению структуры данного участка и к аттенуации вируса [6].

E. Hoffmann и соавт. [6] было показано, что для проявления аттенуированного фенотипа В/АА обязательно присутствие замен в ВМ1. Z. Chen и соавт. [4] показано, что присутствие в геноме вируса сегмента, кодирующего ВМ1 B/AA, приводит к снижению титра вируса в культуре клеток куриного эмбриона при 33 и 37 °C, не влияя на показатели репликации при 25 °C, а также в клетках MDCK. В исследовании есть данные, что ведущую роль в формировании ts фенотипа В/АА играет замена M183V в ВМ1, но для аттенуации необходимы обе. Авторы предполагают, что данные замены расположены в участках белка ВМ1, взаимодействующих с хозяйскими факторами.

Кристаллическая структура С-концевого домена матриксного белка вирусов гриппа не установлена. Многократные попытки получить кристаллическую структуру М1 вирусов гриппа, А при различных значениях рН [30, 35, 36] привели исследователей к выводу, что на С-конце М1 располагается крайне гибкий участок, не обладающий постоянной структурой, в составе которого можно выделить 3 альфа-спирали, не имеющих жестких взаимодействий между собой [37, 38]. Имеются данные о роли С-концевого участка М1 в олигомеризации матриксного белка вирусов гриппа, А [39, 40]. Можно предположить, что аминокислотные замены H159Q и M183V у B/AA, а также замена, обнаруженная в данном участке у В60, действуют сходным образом, изменяя температурный оптимум олигомеризации матриксного белка ХА вирусов за счет влияния на свойства гибкого С-концевого домена.

Белок ВМ2 вируса гриппа В также кодируется 7-м сегментом генома. Тетрамерный трансмембранный домен формирует протонный канал в вирусной липидной оболочке, активирующийся при изменении рН. Цитоплазматический домен также функционирует в тетрамерной форме. Он сформирован суперспиралями с биполярным распределением заряда — отрицательно заряженная часть суперспирали взаимодействует с ВМ1; за счет этого ВМ2 вовлечен в процесс примембранной аккумуляции ВМ1 в процессе отпочковывания вируса гриппа от мембраны [33]. Жесткая структура, необходимая для корректной реализации функций белка, по всей видимости объясняет небольшое количество замен, обнаруженных у ХА вирусов в ВМ2, а также их нерадикальный характер.

ВМ2 состоит из 109 аминокислотных остатков. Суперспиральная укладка как трансмембранного, так и цитоплазматического доменов обеспечивается за счет множественных взаимодействий аминокислот в структуре, подробно описанных в исследовании [33]. Ключевую роль играют гидрофильность и гидрофобность аминокислот, локализованных в разных участках суперспирали. В трансмембранной части аминокислоты, обращенные к внешней части канала, формируют гидрофобную поверхность, поверхность поры сформирована гидрофильными остатками, обеспечивающими эффективный транспорт протонов (S9, S12, S16, H27, Q30). При олигомеризации структура поддерживается связями, формирующимися между остатками, расположенными в разных мономерах.

В трансмембранной части белка ВМ2 располагается замена M21V у ХА вируса BV22, сохранившаяся у BV37. Позиция 21 обращена вне канала (см. рис. 2, в), в участок гидрофобной поверхности, замена метионина на валин не нарушает гидрофобности в данном участке. Данная позиция гетерогенна среди вирусов гриппа В, чаще всего в данной позиции расположен метионин, встречаются также валин или изолейцин. Радикальные замены в данной позиции, очевидно, приводят к нежизнеспособным вариантам вируса. Вирус В14 в позиции 21 также содержит не массовый вариант аминокислоты — изолейцин.

Укладка аминокислотных остатков 34−43, формирующих часть, связывающую два домена и расположенную в толще липидного слоя, не определена экспериментально.

Аминокислотные остатки 45−85 цитоплазматического домена ВМ2 формируют левозакрученные суперспирали, олигомеризующиеся в тетрамерную структуру. Гидрофильные аминокислотные остатки обращены наружу суперспирали, гидрофобные располагаются внутри тетрамера, в противоположность организации трансмембранного домена. Шпилечная структура, состоящая из остатков 86−92, соединяет суперспирализованную часть с короткой амфипатической спиралью (93−103), расположенной перпендикулярно к суперспирализованной и обеспечивающей взаимодействие ВМ2 с ВМ1: предполагают, что отрицательно заряженная С-концевая часть ВМ2 (84−108) взаимодействует с положительно заряженными поверхностными остатками N-терминального домена ВМ1 [33]. В линкерном участке 86−92 расположена аминокислотная позиция 87, в которой описана замена I87V у BV37 (см. рис. 2, в). У ХА вируса В14 в данной позиции также расположен валин, также в данной позиции валин выявлен у нескольких вариантов B/Lee/40, B/Hong Kong/05/1972, B/Ann Arbor/1/1986 (см. табл. 3). По характеру расположения можно предположить, что данная замена вовлечена во взаимодействие с ВМ1.

Восьмой сегмент генома вируса гриппа кодирует неструктурные белки — NS1 и NS2.

NS1 вирусов гриппа В функционирует в виде димера, среди его функций — подавление синтеза белков клетки-хозяина, ингибирование противовирусного иммунного ответа [41]. На N-конце белка (1−103) располагается днРНК-связывающий домен. Домен сформирован шестью α-спиральными участками (15−93), формирует симметричный димер, α₂/α₂′-спиралями сформирован обширный положительно заряженный участок, связывающий днРНК. Консервативные участки заряженной поверхности ориентированы под углом 45° по отношению к осям спиралей α₂ и α₂′, формируя днРНК-связывающий глубокий карман [41].

Между аминокислотными остатками 78−103 NS1 вирусов гриппа В расположен сайт связывания с U6 мяРНК, за счет чего реализуется функция ингибирования сплайсинга хозяйских пре-мРНК [42]. Также в N-терминальном домене NS1 вирусов гриппа В располагается сайт связывания с интерферониндуцируемым антивирусным убиквитинподобным белком ISG15 человека [43].

Замены, описанные в NS1 ХА вирусов, локализованы в N-концевой части. У вируса В/Вик/63 обнаружена замена G13S, по данным C. Yin и соавт. [41], это участок с неустойчивой структурой, на рис. 2, г этот остаток не представлен. Вирус BV22 приобрел замену A25T, сохранившуюся у варианта BV37 (см. рис. 2, г) — данная замена расположена в α₁ на внешней стороне α-спирали, не обращенной к РНК-связывающему каналу. Возможно, данная замена участвует в перераспределении заряда в РНК-связывающем домене, либо во взаимодействии N