Уровень эксцизионных колец Т-клеточных рецепторов и κ-делеционного элемента В-клеток у здоровых людей в разных возрастных группах

На этапе созревания Т- и В-лимфоцитов происходит V(D)J-рекомбинации участков ДНК, что способствует формированию разнообразных репертуаров Т-клеточных рецепторов (TCR) и В-клеточных рецепторов (BCR), которые позволяют распознавать неограниченное количество антигенов [1]. На этапах созревания Т- и В-лимфоцитов рекомбинация участков ДНК позволяет формировать различные варианты клеточных рецепторов. Во время каждой такой рекомбинации происходит вырезание небольшого фрагмента ДНК, в результате чего образуются эксцизионные кольца.

В процессе формирования TCR вырезанные фрагменты ДНК образуют эксцизионные кольца рекомбинации Т-клеточных рецепторов (TREC), которые экспортируются в цитоплазму Т-клеток [2, 3, 4]. На этапе формирования BCR формируются эксцизионные кольца рекомбинации В-клеточных рецепторов (KREC) [4].

Молекулы TREC присутствуют примерно в 70% дифференцирующихся Т-клеток, которые образуются в тимусе [5]. Известно, что с возрастом наблюдается снижение уровней TREC и KREC [6, 7].

В педиатрии для оценки функциональной активности тимуса и костного мозга выполняется определение уровней TREC и KREC. Уменьшение уровней TREC и/или KREC в крови может свидетельствовать о наличии иммунодефицита. Если для первичных иммунодефицитов (ПИД) характерны врожденные (генетические или эмбриопатии) дефекты иммунной системы, то предикторы вторичных иммунодефицитов весьма разнообразны. Известно, что распространенность ПИД достигает примерно 1 случая на 10 000 [8, 9]. Вторичные иммунодефициты часто являются результатом осложнения различных заболеваний.

Использование количественного анализа TREC и KREC постепенно расширяется, и его можно использовать в качестве инструмента для мониторинга Т- и В-клеток после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток и иммуносупрессивной терапии, восстановления иммунитета у пациентов с ВИЧ, прогнозирования субпопуляций лимфоцитов и стратификации пациентов с общим вариабельным иммунодефицитом (ОВИД) или другими формами ПИД [10—13]. Тем не менее, чтобы использовать количественную оценку TREC и KREC, как указано выше, необходимо установить референсные интервалы и пороговые значения не только для новорожденных, но и для здоровых людей разных возрастов или демографических групп, поскольку уровни TREC и KREC с увеличением возраста имеют тенденцию к снижению [6].

У взрослых состояние как приобретенного, так и врожденного иммунодефицита часто не диагностируется и протекает с различными симптомами, которые могут быть связанны с инфицированием. У взрослых в основном регистрируют гипогаммаглобулинемии, а постановка диагноза происходит на третьем десятилетии жизни [5]. Доказано, что использование количественной оценки TREC и KREC в качестве маркеров созревания Т- и В-лимфоцитов важно для оценки клинической тяжести пациентов с ОВИД, а также для дифференциации от комбинированного иммунодефицита [10].

Цель этого исследования — определить возрастные физиологические уровни и пороговые значения уровней TREC и KREC у мужчин и женщин.

В исследование включены результаты анализов 213 здоровых добровольцев (доноров) в возрастном интервале от 18 лет до 82 лет. Медиана возраста составила 46 лет.

Из анамнеза жизни и электронной медицинской документации доноров известно об отсутствии у них онкопатологии, хронических заболеваний и острых воспалительных процессов.

Венозную кровь для исследования забирали по стандартной технологии в вакуумную пробирку. Вакуумная пробирка содержала калиевые соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (К2ЭДТА).

Для тотальной выделения экстракции ДНК из цельной венозной крови использовался комплект реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия; каталожный номер — K2-9-Et-100). Исследуемая кровь обрабатывалась раствором для лизиса, в результате чего происходит деструкция клеточных мембран форменных элементов крови и наблюдается высвобождение нуклеиновых кислот и клеточных компонентов. После добавления раствора для преципитации и центрифугирования растворенная ДНК выпадает в осадок, а другие компоненты лизированного материала остающиеся в растворе удаляются последующими отмывками. На завершающей стадии экстракции проводится растворение осадка в буфере для элюции, очищенная ДНК переходит в раствор. В результате выполненных процедур получали очищенный препарат ДНК. Количественный анализ TREC и KREC проводили с использованием набора реагентов «ИММУНО-БИТ (АБВ-тест, Россия) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Для исследования использовали анализаторы: амплификатор Real-time CFX96, Bio-Rad Laboratories, США; детектирующий амплификатор ДТ-96, ДНК-Технология, Россия. Исследование проводили в соответствии с отработанной методикой согласно инструкции производителя [6].

Принцип исследования основан на количественном определении содержания ДНК TREC и KREC, который выполняется с использованием процесса амплификации участков ДНК TREC и KREC с помощью специфических к этим участкам праймеров, гибридизационных зондов и Taq ДНК-полимеразы с последующим определением накопления специфического флуоресцентного сигнала в режиме реального времени. Линейный диапазон количественного определения копийности TREC и KREC определенный с помощью калибраторов набора реагентов «ИММУНО-БИТ» составляет от 1×10³ до 1×10⁷ копий/мл. В наборе применяется технология TaqMan с флуоресцентными зондами для определения трех типов мишеней: одной реакции, которая определяет количество копий генов альбумина (ALB) и две реакции на TREC и KREC. Предел обнаружения участков ДНК с использованием стандартной панели образцов «СП TREC/KREC/ALB» составляет: 1×10³ копий ДНК TREC на 1 мл образца нуклеиновых кислот; 1×10³ копий ДНК KREC на 1 мл образца нуклеиновых кислот; 1×10³ копий ALB на 1 мл образца нуклеиновых кислот.

Количество копий TREC (KREC) на 10⁵ ядросодержащих клеток (преимущественно лейкоцитов) с учетом ALB рассчитывались по формуле: количество TREC (KREC) = 200 000 × (количество копий TREC (KREC) на мл / количество копий ALB).

В исследование вошли 104 (49,0%) мужчин и 109 (51,0%) женщин. Распределение по возрастным группам в зависимости от гендерной принадлежности представлено в табл. 1.

Таблица 1. Распределение доноров по возрастным группам и полу

Статистический анализ проводился с использованием программы StatTech v. 4.7.1 (разработчик — ООО «Статтех», Россия).

Количественные показатели оценивались на соответствие нормальному распределению с помощью критерия Шапиро—Уилка (при числе исследуемых менее 50) и критерия Колмогорова—Смирнова (при числе исследуемых более 50).

В случае отсутствия нормального распределения количественные данные описывались с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q1 — Q3).

Сравнение двух групп по количественному показателю, распределение которого отличалось от нормального, выполнялось с помощью U-критерия Манна—Уитни. Корреляционная связь между двумя количественными показателями оценивались с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (при распределении показателей, отличном от нормального).

Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

По результатам исследования отмечено, что у доноров независимо от возраста наблюдался широкий разброс концентрации TREC, что возможно указывает на индивидуальные особенности (табл. 2).

Таблица 2.Уровень TREC (копий/10⁵ клеток) среди здоровых лиц мужского (n=104) и женского пола (n=109)

При оценке концентрации TREC в зависимости от гендерной принадлежности статистически значимые различия (p=0,137) не выявлены.

Результаты определения уровня KREC представлены в табл. 3.

Таблица 3. Уровень KREC (копий/10⁵ клеток) среди здоровых лиц мужского (n=104) и женского пола (n=109)

При сравнении концентрации KREC среди мужчин и женщин достоверные различия не выявлены (p=0,75).

Для определения динамики изменения уровня TREC в зависимости от возраста нами был проведен корреляционный анализ (рис. 1). Наблюдаемая зависимость TREC от возраста описывается уравнением парной линейной регрессии:

Y_TREC = –6,587 × Х_{ВОЗРАСТ} + 440,073

Рис. 1. График регрессионной функции, характеризующий зависимость уровня TREC (копий/10⁵ клеток) от возраста.

Ось X (абсцисс) — возраст пациента в годах; Ось Y (ординат) — количество копий TREC (копий/10⁵ клеток), определяемых в периферической крови; TREC — Т-рецепторное эксцизионное кольцо

При оценке зависимости уровня TREC от возраста нами была установлена сильная отрицательная связь (теснота связи по шкале Чеддока; ρ = –0,773; p<0,001). С увеличением возраста пациента на 1 год следует ожидать уменьшение TREC на 6,587 копий/10⁵ клеток.

Представленные результаты демонстрируют, что с увеличением возраста наблюдается уменьшение уровня TREC, что вероятно связано с инволюцией тимуса и отражает снижение потенциала Т-клеточного иммунитета.

Ранее другими авторами при определении TREC и KREC использовались различные возрастные интервалы для формирования группы сравнения [6, 7]. Применение возрастных групп обосновано необходимостью определения референсных норм концентрации TREC и KREC для пациентов старше 17 лет [6] и тем, что возрастные изменения организма могут быть сопряжены с изменениями в иммунной системе. Для изучения концентрации TREC и KREC нами формировались группы сравнения, в возрастном интервале предложенной Н.В. Давыдовой с соавторами [6]: от 18 до 24 лет; от 25 до 44 лет; от 45 до 60 лет; старше 60 лет.

Сравнительный анализ концентрации TREC в различных возрастных группах представлен в табл. 4.

Таблица 4. Уровень TREC (копий/10⁵ клеток) в различных возрастных группах

По результатам исследования отмечено, что уровни TREC в различных возрастных группах имеют статистически значимые различия.

При корреляционном анализе уровней KREC в зависимости от возраста была установлена умеренная отрицательная связь (теснота связи по шкале Чеддока; ρ = –0,512; p<0,001). Наблюдаемая зависимость KREC от возраста описывается уравнением парной линейной регрессии:

Y_KREC = –6,975 × Х_{ВОЗРАСТ} + 628,016

Отмечено, что с увеличением возраста пациента на 1 год наблюдалось уменьшение уровня KREC на 6,975 копий/10⁵ клеток (рис. 2).

Рис. 2. График регрессионной функции, характеризующий зависимость KREC (копий/10⁵ клеток) от возраста.

Ось X (абсцисс) — возраст пациента в годах; Ось Y (ординат) — количество копий KREC (копий/10⁵ клеток), определяемых в периферической крови; KREC — каппа-делеционное рекомбинационное эксцизионное кольцо.

По результатам корреляционного анализа с увеличением возраста отмечается уменьшение уровня KREC, но при этом разные уровни KREC у людей с одинаковым возрастом указывает на индивидуальный характер формирования адаптивного гуморального иммунитета.

Результаты сравнительного анализа концентрации KREC в разных возрастных группах представлены в табл. 5.

Таблица 5. Уровень KREC (копий/10⁵ клеток) в различных возрастных группах

По результатам исследования были выявлены достоверные различия уровней KREC между различными возрастными группами. Между возрастными группами от 25 до 44 лет и от 45 до 60 лет статистически значимых различий нет.

С увеличением возраста наблюдается уменьшение уровня KREC, но при этом разные уровни KREC у людей с одинаковым возрастом указывает на индивидуальный характер формирования адаптивного гуморального иммунитета.

Представленные нами результаты исследования концентрации TREC и KREC указывают на возможность применения данного метода лабораторного исследования для выявления иммунодефицитных состояний у взрослого населения. Полученные нами данные подтверждают информацию других авторов о том, что с увеличением возраста наблюдается уменьшение концентрации TREC и KREC [6, 7].

Ранее в российской популяции похожее масштабное исследование было проведено в 2021 г., тогда анализу подверглись 140 человек [6], где с увеличением возраста отмечено снижение уровня TREC. Уменьшение концентрации TREC и KREC можно использовать для выявления иммунодефицитных состояний. У взрослых иммунодефицитное состояние чаще всего диагностируется поздно, когда появляются клинические симптомы, такие как рецидивирующие инфекции, и для него характерна повышенная чувствительность к инфекциям, аутоиммунным и воспалительным заболеваниям [14].

Мы определили референсные интервалы для взрослых в возрастных группах от 18 до 82 лет для потенциального применения в диагностике иммунодефицитных состояний у взрослого населения.

В нашем исследовании, как и в других работах, обратная корреляционная зависимость между уровнями TREC и возрастом [6, 15, 16] предположительно связано с инволюцией тимуса [18]. Если концентрация TREC с увеличением возраста имеет тенденцию к снижению, то концентрация KREC имеет умеренную отрицательную зависимость от возраста, что указывает на постепенное уменьшение формирования В-клеток на протяжении всей жизни и согласуется с результатами исследований других авторов [18, 19].

Наши результаты не выявили существенных различий в уровне TREC у женщин и мужчин независимо от возраста, что согласуется с исследованиями других авторов [3, 20, 21].

Для диагностики ПИД обычно используют стандартные методы диагностики, которые включают общий анализ крови, подсчет лимфоцитов, измерение уровня иммуноглобулинов, функциональные анализы и генетические тесты. Все традиционные анализы в диагностике ПИД имеют решающее значение, но при этом трудозатратные и несут финансовую нагрузку. Анализ TREC и KREC — это быстрый, экономичный и чувствительный инструмент для диагностики ПИД, особенно с учетом того, что для выделения ДНК требуется небольшой объем венозной крови. Выполнение стандартных методов исследований может оказаться невозможным, что часто связано с недостатком биоматериала (крови). Многими авторами отмечено, что применение методов определения концентрации TREC и KREC значительно сократит расходы на диагностику различных заболеваний, связанных с иммунодефицитом [6, 22, 23, 24].

Из результатов исследования следует, что уровни TREC и KREC снижаются с возрастом. В разных возрастных группах доноров нами были получены референсные значения физиологических уровней TREC и KREC. Количественное определение уровней TREC и KREC должно быть внедрено в рутинную практику, поскольку позволит диагностировать заболевания, связанных с иммунодефицитом.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.