Организация деятельности лабораторий, осуществляющих HLA-типирование

HLA-типирование — это лабораторное исследование, позволяющее определить HLA-антигены или HLA-гены конкретного индивидуума. Наиболее востребован этот вид лабораторного исследования при проведении трансплантаций органов и тканей, при определении иммуногенетических факторов, ассоциированных с развитием целого ряда различных заболеваний (аутоиммунные, инфекционные и др.), а также маркеров, определяющих непереносимость или резистентность к некоторым лекарственным препаратам.

В отечественных учреждения здравоохранения лаборатории, выполняющие HLA-типирование, носят наименования «лаборатория тканевого типирования», «лаборатория иммунологического типирования тканей», «HLA-лаборатория». Для успешного осуществления HLA-лабораторией своих функций необходимы ее рациональная организация и обеспечение требуемых условий для выполнения иммуногенетических исследований, адекватное соотношение затрат трудовых и материальных ресурсов с полученным результатом; обеспечение безопасности персонала, окружающей среды. Взаимосвязанность и взаимодействие вышеперечисленных элементов обеспечивают систему качества работы HLA-лаборатории. Особенностью деятельности HLA-лабораторий является получение не количественных, а высокоточных качественных характеристик, при этом результаты исследований должны отвечать следующим требованиям: достоверность, сопоставимость, оперативность, эффективность В настоящее время в нашей стране существует обширная нормативная база по лабораторной медицине — действует большое число нормативных документов, но ни в одном из них не содержатся требования, предъявляемые к HLA-лабораториям, отсутствует программа внешнего контроля качества иммуногенетических исследований. Поэтому представляется актуальным сформулировать требования к лаборатории, выполняющей HLA-типирование, на основании действующих отечественных нормативных актов и международных правил, с учетом опыта работы авторов в этой области, что позволит совершенствовать организацию и повысить эффективность деятельности HLA-лабораторий.

Цель статьи — обобщение принципов организации HLA-лабораторий, требований к персоналу лаборатории, к менеджменту качества, к обращению с биологическим материалом и к стандартизации оснащения лаборатории.

Материал и методы. Для достижения поставленной цели были проанализированы действующие отечественные и международные нормативные документы, а также основные научные публикации последних 5 лет.

Результаты. Деятельность HLA-лаборатории осуществляется в первую очередь в соответствии с отечественными нормативными документами:

Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 18.05.2021 № 464н «Об утверждении Правил проведения лабораторных исследований» (с изменениями и дополнениями) действует с 01.09.2021 [1]; Приказ № 380 от 25.12.1997 «О состоянии и мерах по совершенствованию лабораторного обеспечения диагностики и лечения пациентов в учреждениях здравоохранения РФ, действует [2]; Приказ Минздрава РФ от 02.05.2023 № 205н «Об утверждении номенклатуры должностей медицинских работников и фармацевтических работников» [3]; Сан ПиН 3.3686–21 Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней (Постановление главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28 января 2021 года № 4 с изменениями от 11.02.2022, 25.05.2022 и 25.06.2025) [4]; Сан ПиН 2.1.3684–21 Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических мероприятий) [5]; Межгосударственный стандарт ГОСТ 33044–2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики» [6] и др. Следует отметить, что все вышеперечисленные документы не содержат конкретных специфических критериев, которым должны соответствовать лаборатории, выполняющие HLA-типирование. С 1 марта 2023 г. действует приказ Министерства здравоохранения РФ № 519-н от 29 июля 2022 г. «Об утверждении Порядка проведения медицинского обследования донора, давшего письменное информированное добровольное согласие на изъятие своих органов и (или) тканей для трансплантации», регламентирующий требования к организациям, осуществляющим HLA-типирование потенциальных доноров органного и клеточного трансплантата [7].

В международном стандарте ISO 15189, описывающем требования к системе менеджмента качества медицинских лабораторий, рассматриваются особенности диагностических исследований и взаимодействие лабораторий с лечебными учреждениями, также как и Национальный стандарт РФ ГОСТ Р ИСО 15189–2024 [8], но этот стандарт не является специфичным для конкретных лабораторных дисциплин. В связи с этими фактами лаборатории нашей страны в той или иной мере используют Стандарты гистосовместимости и иммунологического обследования Европейской федерации иммуногенетики (European Federation of Immunogenetics, EFI), первая версия которых была разработана еще в 1995 г. Систематически происходит пересмотр этого документа Комитетом стандартов EFI на основании предложений, поступающих из лабораторий, и их экспертной оценки. В настоящее время действует уже версия 8.1. [9], определяющая минимальные критерии, которым должны соответствовать все HLA-лаборатории, чтобы результаты выполняемых ими исследований были валидными. Несомненно, что многие международные стандарты, касающиеся кадровых, организационных, методических вопросов, рационально реализовывать и в лабораториях нашей страны, но, безусловно, во взаимосвязи с положениями отечественных нормативных документов. А участие отечественных лабораторий во внешнем контроле качества HLA-типирования, организуемом EFI в отсутствии аналогичного контроля, организованного аккредитованными системами в нашей стране, является необходимым условием подтверждения качества иммуногенетических исследований.

Адекватные результаты типирования, соответствующая международным правилам регистрация этих результатов, могут быть получены в лаборатории, оснащенной современным оборудованием, работающей в соответствии с законодательством РФ и международными стандартами, что посильно только высокопрофессиональным коллективам лабораторий, возглавляемым компетентными руководителями.

Можно условно выделить несколько категорий персонала HLA-лаборатории: управленческий, основной и вспомогательный персонал. К управленческому персоналу относится заведующий HLA-лабораторией, который должен иметь высшее медицинское образование, послевузовское профессиональное образование и (или) дополнительное профессиональное образование и сертификат специалиста по специальности «Клиническая лабораторная диагностика», и, в соответствии с международными стандартами, иметь опыт работы в области иммуногенетики не менее 5 лет. В международной практике согласно Стандартам EFI заведующий HLA-лабораторией может иметь высшее биологическое образование при обязательном наличии опыта работы в области иммуногенетики не менее 5 лет. К основному персоналу относятся: врач клинической лабораторной диагностики (КЛД), биолог HLA-лаборатории и специалист со средним медицинским образованием (медицинский техник, фельдшер-лаборант, лаборант), имеющие аккредитацию по специальности «Клиническая лабораторная диагностика» или «Генетика». К вспомогательному персоналу относятся IT-специалисты, сотрудники, выполняющие уборку помещений и др.

Заведующий HLA-лабораторией должен знать принципы организации здравоохранения и общественного здоровья; принципы социальной гигиены; основы противопожарной безопасности; правила техники безопасности на рабочем месте в лаборатории при работе с лабораторным оборудованием, электроприборами, агрессивными средами; санитарно-эпидемиологические требования к условиям и организации работы в лаборатории иммунологического типирования тканей; строение и функции системы главного комплекса гистосовместимости; современную номенклатуру антигенов и генов HLA-системы; методы определения HLA-фенотипа, HLA-генотипа и HLA-гаплотипа; закономерности антителообразования у реципиентов органов и тканей; организацию иммуногенетического обследования доноров и пациентов; алгоритмы определения степени гистосовместимости донора и реципиента; вопросы экономики, управления и планирования в службе иммунологического типирования тканей; правовые основы деятельности заведующего, врача КЛД, биолога и среднего персонала HLA-лаборатории; отечественные и международные требования к профессиональной компетенции врачей, биологов и среднего и вспомогательного персонала HLA-лабораторий; отечественные и международные требования к проведению преаналитического, аналитического и постаналитического этапов иммуногенетического обследования, обеспечивающие гарантии качества исследований.

Заведующий HLA-лабораторией должен уметь осуществлять необходимый перечень иммуногенетических методов исследования в соответствиями с клинической работой учреждения; правильно эксплуатировать лабораторное оборудование; интерпретировать результаты иммунологических тестов; оформлять в установленном порядке результаты лабораторных тестов и давать по ним заключение в виде ответов в клинические подразделения; планировать ежегодные поверки оборудования, участие лаборатории во внешнем контроле качества, проводить анализ качественных показателей работы персонала лаборатории; систематически повышать свою и персонала лаборатории квалификацию путем чтения специальной литературы, участия в заседаниях научных обществ, научно-практических конференциях, семинарах; контролировать работу всего персонала HLA-лаборатории.

Врач клинической лабораторной диагностики / врач-генетик HLA-лаборатории должен знать строение и функции системы главного комплекса гистосовместимости; современную номенклатуру антигенов и генов HLA-системы; методы определения HLA-фенотипа, HLA-генотипа и HLA-гаплотипа; закономерности антителообразования; алгоритмы определения степени гистосовместимости донора и реципиента; организацию иммуногенетического обследования доноров и пациентов; правовые основы деятельности врача КЛД, лаборатории тканевого типирования; отечественные и международные требования к профессиональной компетенции врачей КЛД-лабораторий иммунологического типирования тканей; отечественные и международные требования, обеспечивающие гарантии качества исследований, выполняемых в лаборатории иммунологического типирования тканей; отечественные и международные требования к проведению преаналитического, аналитического и постаналитического этапов иммуногенетического обследования.

Врач клинической лабораторной диагностики / врач-генетик HLA-лаборатории должен уметь осуществлять необходимый перечень иммуногенетических методов исследования; правильно эксплуатировать лабораторное оборудование; интерпретировать результаты иммунологических тестов; устанавливать HLA-фенотип, HLA-генотип и HLA-гаплотип; определять наличие и специфичность анти-HLA-антител в сыворотке обследуемых; оценивать результаты индивидуальной перекрестной пробы; оформлять в установленном порядке результаты лабораторных тестов в виде ответов в клинические подразделения; определять степень гистосовместимости донора и реципиента; контролировать работу среднего персонала HLA-лаборатории; проводить анализ качественных показателей своей работы; систематически повышать свою квалификацию путем чтения специальной литературы, участия в заседаниях научных обществ, научно-практических конференциях, семинарах.

Биолог HLA-лаборатории должен знать строение и функции системы главного комплекса гистосовместимости; современную номенклатуру антигенов и генов HLA-системы; методы определения HLA-фенотипа, HLA-генотипа и HLA-гаплотипа; закономерности антителообразования; организацию иммуногенетического обследования доноров и пациентов; отечественные и международные требования к профессиональной компетенции биологов HLA-лабораторий; отечественные и международные требования, обеспечивающие гарантии качества исследований, выполняемых в HLA-лабораториях; отечественные и международные требования к проведению преаналитического, аналитического и постаналитического этапов иммуногенетического обследования.

Биолог HLA-лаборатории должен владеть лабораторными методами, используемыми на всех этапах иммуногенетического обследования, правильно эксплуатировать лабораторное оборудование; интерпретировать результаты иммунологических тестов; устанавливать HLA-фенотип, HLA-генотип и HLA-гаплотип; определять наличие и специфичность анти-HLA-антител в сыворотке обследуемых; оценивать результаты индивидуальной перекрестной пробы; оформлять в установленном порядке результаты лабораторных тестов; определять степень гистосовместимости донора и реципиента; проводить анализ качественных показателей своей работы; систематически повышать свою квалификацию путем чтения специальной литературы, участия в заседаниях научных обществ, научно-практических конференциях, семинарах; контролировать работу среднего персонала HLA-лаборатории.

Специалист HLA-лаборатории со средним медицинским образованием должен знать основы строения и функций системы главного комплекса гистсовместимости; современную номенклатуру антигенов и генов HLA-системы; основные методы определения HLA-фенотипа и анти-HLA-антител; правила эксплуатации лабораторного оборудования; санитарные правила и нормы для обслуживания помещений, оснащения и инвентаря лаборатории; осуществлять необходимый перечень иммуногенетических методов исследования (преаналитический этап); правильно эксплуатировать лабораторное оборудование.

Специалист должен владеть методами выделения лимфоцитов из периферической крови и лимфоидных органов; методами определения количества и качества выделенных лимфоцитов; методикой постановки микролимфоцитотоксического теста; методами выделения ДНК из клеток периферической крови и буккального эпителия; методами определения количества и качества выделенной ДНК; техникой постановки полимеразной цепной реакции, техникой проведения электрофореза продуктов амплификации в агарозном геле.

Обязательным требованием в работе с персоналом лаборатории является организация системы постоянного обучения персонала и системы регулярной ежегодной оценки компетенции каждого сотрудника лаборатории, а также периодической аттестации (в соответствии с установленными требованиями).

Помещения лаборатории могут быть размещены как в отдельном здании, так и в многопрофильном корпусе медицинского учреждения. Предпочтительно использовать боксированные несмежные помещения, обязательно промаркированные (нумерация или название рабочих зон) и оборудованные приточно-вытяжной вентиляцией, водопроводом, канализацией, электричеством, отоплением, средствами пожаротушения, естественным и искусственным освещением. Внутренняя отделка помещений должна быть устойчива к действию моющих и дезинфицирующих средств. Обязательным условием является выделение пре- и пост-ПЦР-зон, разделенных барьером, например, дверью. Планировка помещений и размещение в них оборудования должны обеспечивать движение исследуемого материала только в одном направлении — из пре-ПЦР-зоны в пост-ПЦР. Во всех помещениях рабочих зон должно быть предусмотрено достаточное по размерам пространство для безопасного и надежного хранения проб, реагентов, а также лабораторных отходов на период до их удаления. В помещениях, где расположено оборудование, требующее строгого температурного режима для корректной работы, должны быть установлены кондиционеры, в остальных помещениях должен осуществляться ежедневный контроль температурного режима. Каждая рабочая зона должна быть оснащена набором соответствующего лабораторного оборудования в зависимости от ее функционального назначения, необходимым комплектом мебели, расходных материалов, защитной одежды, используемых только в данном помещении. Все оборудование, располагающееся в пре- и пост-ПЦР-зонах, должно иметь четкую маркировку в соответствии с зоной размещения. Перемещение оборудования из пост-ПЦР в пре-ПЦР-зону категорически запрещено. Необходимо иметь отдельный уборочный инвентарь с соответствующей маркировкой в пре-ПЦР и пост-ПЦР-зонах. В состав лаборатории могут быть включены вспомогательные помещения (комнаты персонала, кабинет заведующего лабораторией, раздевалки для сотрудников, комната приема пищи, туалет, подсобные помещения), которые должны быть вынесены за пределы рабочих зон.

В пре-ПЦР-зоне осуществляют прием биологического материала, его регистрацию, при необходимости — разделение проб на аликвоты, их хранение, обеззараживание остатков исследуемого материала. В пре-ПЦР-зоне выполняются следующие виды работ: выделение геномной ДНК человека, оценка качества и количества выделенной ДНК; сборка реакционных смесей для проведения ПЦР. В пост-ПЦР-зоне выполняются следующие виды работ: реакция ПЦР и реакция секвенирования (амплификаторы размещаются только в пост-ПЦР зоне); детекция продуктов ПЦР методом горизонтального электрофореза и фотоархивирование электрофореграмм; гибридизация продуктов амплификации с сиквенс-специфическими олигонуклеотидными зондами с последующей детекцией колориметрическим методом или методом мультиплексного флуоресцентного анализа; очистка продуктов амплификации, проведение пробоподготовки для проведения реакции секвенирования, получение результатов секвенирования и их последующая интерпретация с помощью программного обеспечения; внесение полученных результатов в электронную базу данных.

Система менеджмента качества HLA-типирования включает в себя следующие мероприятия:

— контроль ведения внутренней документации;

— актуализация стандартных операционных процедур (СОП) посредством проверки СОП заведующим лабораторией каждые два года;

— контроль обращения с биологическим материалом, поступающим в лабораторию;

— контроль обращения с выделенными образцами ДНК;

— контроль правильности получаемых результатов путем проведения внутрилабораторного контроля качества HLA-типирования, выполняемого методом анализа заранее исследованного образца ДНК в соответствии с графиком, ежегодно утверждаемым руководителем лаборатории;

— проведение внешнего контроля качества HLA-типирования;

— разбор всех лабораторных ошибок с установлением причин и разработки последующих корректирующих мероприятий;

— систематический контроль за вводом в эксплуатацию нового оборудования;

— постоянный контроль за поддержанием оборудования в исправном состоянии, включающим планирование и выполнение своевременной ежегодной поверки центрифуг, термоциклеров, секвенаторов, средств измерения (автоматических дозаторов), строгое соответствие расходуемых материалов используемому оборудованию;

— контроль качества реагентов: валидация каждого вновь поступающего лота реагентов, условия хранения наборов реагентов в соответствии с инструкциями по применению, раздельное хранение реагентов и образцов, содержащих нуклеиновые кислоты или ампликоны, постоянный мониторинг используемых реагентов;

— контроль контаминации, включающий регулярный (каждые 2 месяца) контроль путем исследования смывов с рабочих поверхностей оборудования и поверхностей помещений с помощью специальных тест-наборов. Случаи контаминации необходимо регистрировать в специальном журнале с указанием мероприятий по ее устранению и результатов последующего внутрилабораторного контроля. Проведение работ, связанных с амплификацией ДНК, до завершения деконтаминационных мероприятий в лаборатории не допускается;

— предупреждение конфликта интересов и обеспечение независимости результатов исследований от любого давления;

— контроль соблюдения санитарно-эпидемиологических правил и нормативов;

— регулярное проведение внутренних аудитов всех рабочих процессов.

Необходимый комплект лабораторного оборудования определяют с учетом используемых в лаборатории методов HLA-типирования (табл. 1, табл. 2).

Таблица 1. Примерный перечень оборудования пре-ПЦР-зоны лаборатории HLA-типирования

Таблица 2. Примерный перечень оборудования пост-ПЦР-зоны лаборатории HLA-типирования

Оборудование и приборы, используемые в работе лаборатории, должны быть зарегистрированы в установленном порядке и исправны, иметь технический паспорт и рабочую инструкцию по эксплуатации. Не реже 1 раза в год измерительные приборы должны подвергаться метрологическому контролю (поверке). Все вновь поступающие в лабораторию приборы и оборудование должны быть валидированы в условиях лаборатории. Рекомендуется использование источников бесперебойного питания.

Холодильное оборудование должно быть оснащено средствами ручного или автоматического температурного контроля и регистрации, свидетельствующими о реальном режиме хранения наборов реагентов и исследуемых проб.

Лабораторная мебель, оборудование и принадлежности каждой рабочей зоны должны иметь маркировку указанной зоны, их применение в других рабочих зонах или для других видов исследований не допускается.

Лаборатория должна быть обеспечена аптечкой стандартной комплектации для оказания первой медицинской помощи в экстренных ситуациях в соответствии с действующими санитарными правилами.

Биологический материал, поступающий в лабораторию, обязательно должен иметь маркировку (с указанием фамилии, имени, отчества пациента или донора, даты рождения и даты взятия материала) и сопровождаться направлением врача, которое должно содержать информацию о пациенте или доноре, указание необходимого вида исследования, а также контактные данные врача, выдавшего направление на исследование. В лаборатории должны быть разработаны строгие критерии, которым должен соответствовать поступающий биообразец. В случае несоответствия этим критериям биологический образец не должен регистрироваться, о чем информируется врач, направивший на исследование. Отказ в приеме биологического материала фиксируется в отдельном журнале с указанием причины, а биообразец должен быть уничтожен в соответствии с санитарными нормами и правилами. Все поступающие в HLA-лабораторию для исследования биологические образцы должны рассматриваться как потенциально инфицированные.

Лаборатория, осуществляющая HLA-типирование, представляет собой сложную систему взаимосвязанности и взаимодействия правильно организованной инфраструктуры, персонала и технологических процессов, что и обеспечивает качество работы этой лаборатории. Особенностью деятельности HLA-лабораторий является получение не количественных, а качественных характеристик, и результаты исследования одних и тех же образцов, полученные в разных лабораториях, должны быть идентичны, а не просто коррелировать между собой.

Применение представленных требований к организации HLA-лабораторий направлено на повышение эффективности и оптимизации их деятельности, что позволит повысить эффективность как подбора пар донор—реципиент для выполнения трансплантации, так и определения диагностически значимых иммуногенетических факторов, ассоциированных с развитием целого ряда различных заболеваний (аутоиммунных, инфекционных и др.) и маркеров, определяющих непереносимость или резистентность к некоторым лекарственным препаратам.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.