Введение
Одной из актуальных проблем современного здравоохранения стал рост заболеваемости ВИЧ-инфекцией [1, 2]. Часть ВИЧ-инфицированных пациентов характеризуется низкой комплаентностью относительно приема высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААР, АРТ или АРВТ), что сопровождается увеличением числа пациентов с терминальной стадией ВИЧ-инфекции — синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД) [3, 4].
Вирус иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1) характеризуется высокой тропностью не только к лимфоцитам, но и к клеткам нервной ткани (нейронам и глиальным клеткам) [5—7]. Это обуславливает разнообразные неврологические проявления при данной инфекции [8, 9]. При этом ранние неврологические проявления, обусловленные прямым нейроцитопатогенным действием ВИЧ, могут наблюдаться уже в остром периоде инфекции [10, 11]. Поздние проявления поражения нервной системы имеют сложный патогенез и являются не только результатом непосредственного поражения клеток вирусом, но и активацией различных инфекционных агентов, которые при нормальном состоянии иммунитета, как правило, не вызывают клинически значимого поражения центральной нервной системы (ЦНС) [12—14].
Одним из таких инфекционных агентов является Toxoplasma gondii — возбудитель токсоплазмоза — заболевания, для которого в подавляющем большинстве случаев характерно латентное течение. Данный возбудитель представляет наибольшую опасность для плода и новорожденных родившихся у женщин, инфицирование которых произошло во время беременности [15, 16]. У взрослых инфицирование токсоплазмозом протекает, как правило, бессимптомно и является актуальным лишь для лиц с резко сниженным иммунитетом. У ВИЧ-позитивных пациентов в стадии СПИД чаще наблюдается реактивация скрытой инфекции [17, 18], при этом именно токсоплазмоз ЦНС является основной причиной тяжелой неврологической патологии у пациентов на поздней стадии ВИЧ-инфекции на территории Российской Федерации [19, 20].
Количество публикаций, приводящих результаты исследования состава ликвора у пациентов с токсоплазменным поражением ЦНС в отечественной литературе, явно недостаточно. Поиск по ключевым словам «токсоплазмоз ЦНС» и «исследование ликвора человека» в научной электронной базе https://www.elibrary.ru/ на 25.04.21 отразил данные лишь о 25 публикациях, ни в одной из которых не представлены данные об исследовании индивидуальных белков, пептидов или метаболитов в ликворе.
Неоптерин представляет собой продукт катаболизма гуанозинтрифосфата — пуринового нуклеотида, принадлежащего к группе птеридинов [21—23]. Его способны синтезировать многие клетки, но наиболее часто рассматривается синтез различными клетками при цитокиновой стимуляции [24, 25]. Предполагается его участие в регуляции процессов воспаления, в частности при формировании клеточного иммунитета при различных инфекциях [26—28]. Традиционно исследование неоптерина выполняется в сыворотке крови или моче. Данных о его содержании в биологических жидкостях человека, получение которых сопряжено со сложностью, значительно меньше. Так, нами обнаружены лишь единичные публикации, посвященные результатам анализа неоптерина в ликворе [29]. Интерес к исследованию неоптерина у пациентов с неврологическими заболеваниями обусловлен еще и рядом данных, свидетельствующих о цитопротективном эффекте этого соединения в отношении клеток головного мозга [30].
Цель исследования — изучить содержание неоптерина в ликворе пациентов с различным течением токсоплазмоза ЦНС у ВИЧ-инфицированных пациентов в стадии СПИД.
Материал и методы
Проведено одномоментное обсервационное исследование типа «случай—контроль», выполненное с соблюдением этических принципов проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов, изложенных в Хельсинкской декларации Всемирной организации здравоохранения. На его проведение получено одобрение этического комитета ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет им. акад. Е.А. Вагнера» Минздрава России (прокол №4 заседания этического комитета от 2021 г.).
В исследовании участвовали 44 ВИЧ-инфицированных пациента (27 мужчин и 17 женщин), госпитализированные в краевую клиническую инфекционную больницу Перми с клиническими проявлениями поражения ЦНС. Пациенты были разделены на три группы. Основную группу (1-ю) составили ВИЧ-инфицированные пациенты с клиникой токсоплазменного поражения ЦНС [n=22 (50%) от 44], группу сравнения (2-ю) — ВИЧ-инфицированные пациенты с грибковыми поражениями ЦНС (криптококкозом ЦНС) [n=15(34%) от 44]. Контрольная группа (без явного инфекционного агента) была представлена пациентами, госпитализированными с клинической картиной ВИЧ-ассоциированной энцефалопатии [n=7 (16%) от 44]. Характеристика пациентов представлена в табл. 1.
Таблица 1. Характеристика обследованных
| Характеристика пациентов | 1-я группа (основная) | 2-я группа (сравнения) | 3-я группа (контрольная) | p | |
| 1 | Число | 22 | 15 | 7 | — |
| 2 | Пол, муж/жен | 18/4* | 7/8 | 2/5 | — |
| 3 | Средний возраст, годы (M±SD) | 38,73±6,25 | 36,93±6,76 | 39,29±6,8 | — |
| 3 | Медиана возраста (Ме) и интерквартильный диапазон (25-й и 75-й квартили), годы | 39; 34—44 | 37; 32—43 | 39; 34—43 | Н=0,6499231 (p=0,7226)** |
| 4 | Минимальный и максимальный возраст, годы | 28—48 | 25—47 | 31—52 | — |
Примечание. В числителе количество мужчин, в знаменателе — женщин; различие по критерию: * — χ2; ** — H — Краскела—Уоллиса.
Выполнение люмбальной пункции проводилось строго по медицинским показаниям и после получения информированного согласия пациентов на 1—2-е сутки после госпитализации и на 8—12-е сутки. Одновременно у пациентов забирали образцы крови для лабораторных исследований. Ликвор собирали в сухие чистые пробирки, после выполнения всех необходимых исследований, обезличенные остатки ликвора были использованы для определения концентрации неоптерина. Образцы ликвора и крови центрифугировали на центрифуге Элекон ЦЛМН-Р-10-02 (Россия) в течение 15 мин при 3000 об/мин, аликвотировали в пробирки типа Эппендорф (по 1,0 мл) и до выполнения исследований хранили при температуре –20 °C.
Концентрацию неоптерина определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора Neopterin ELISA (кат. №RE 59321; лот ENO230) («IBL», Германия) с чувствительностью 0,7 нмоль/л. Правильность измерений контролировали по результатам измерения двух контрольных образцов: первый — 5,48 нмоль/л (допустимый предел 3,5—8,1 нмоль/л); второй — 23,34 нмоль/л (допустимый предел 13,6—28,2 нмоль/л).
Оптическую плотность проб регистрировали на вертикальном фотометре StatFax 3200 («Awareness», США).
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ Statistica v. 7 («StatSoft Inc.», США). Для каждого массива данных рассчитывали параметры описательной статистики: среднюю арифметическую (M), стандартное отклонение (SD), а также медиану (Me) и интерквартильный диапазон (25—75 перцентилей). С помощью критерия Шапиро—Уилка оценивали распределение результатов внутри выборки, на основании этих расчетов, для дальнейшей статистической обработки применяли методы непараметрической статистики. Для сравнения концентрации неоптерина между связанными группами использовали критерий Вилкоксона, а для несвязанных групп (n>3) — Н-критерий Краскела—Уоллиса с последующим расчетом межгрупповых различий с помощью медианного теста. Количественную оценку линейной связи между двумя случайными величинами определяли с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена (R). Оценку корреляционной взаимосвязи между содержанием неоптерина в ликворе и сыворотке крови осуществляли с помощью однофакторного линейного регрессионного анализа и построения уравнения линейной регрессии.
За максимально приемлемую вероятность ошибки первого рода (p) принималась величина уровня статистической значимости, равная или меньшая 0,05.
Результаты и их обсуждение
Среднее содержание неоптерина во всех исследованных образцах ликвора в 7,53 раза превысило его средний уровень в сыворотке крови (рис. 1). Средняя концентрация неоптерина в ликворе составила 68,56±39,39 нмоль/л, медиана и интерквартильный диапазон — 67,65 (35,78; 100,2) нмоль/л, при колебании результатов в диапазоне от 10,89 до 138,56 нмоль/л. Эти значения статистически достоверно (p<0,000001) превышали аналогичные результаты для сыворотки крови, где содержание неоптерина составило 9,84±4,17 нмоль/л; медиана и интерквартильный диапазон — 8,98 (7,91; 9,77) нмоль/л, при колебании результатов в диапазоне 5,84—27,53 нмоль/л.
Рис. 1. Концентрация неоптерина (нмоль/л) в сыворотке крови и ликворе обследованных пациентов.
При оценке зависимости концентрации неоптерина между биологическими жидкостями установлено отсутствие значимой зависимости между ликвором и сывороткой крови. Коэффициент корреляции Спирмена (R) между образцами составил 0,234117, что указывает на отсутствие значимой зависимости и подтверждается результатами регрессионного анализа (рис. 2).
Рис. 2. Диаграмма рассеивания результатов параллельного исследования неоптерина (нмоль/л) в образцах ликвора и сыворотки крови.
Значительно более высокий уровень неоптерина в ликворе в сравнении с сывороткой крови свидетельствует в пользу гипотезы о его локальной продукции клетками ЦНС как основного источника данного метаболита в цереброспинальной жидкости и слабой зависимости его концентрации в ликворе от сывороточного уровня неоптерина.
При анализе концентрации неоптерина в группах обследованных пациентов получены данные, представленные на рис. 3. Наиболее высокая концентрация неоптерина обнаружена в ликворе ВИЧ-инфицированных пациентов с криптококкозом, более низкая — у пациентов с токсоплазмозом и наиболее низкая — у ВИЧ-инфицированных пациентов, госпитализированных с энцефалопатией при отсутствии идентифицированного микроорганизма.
Рис. 3. Диаграмма рассеивания результатов исследования неоптерина (нмоль/л) в образцах ликвора ВИЧ-инфицированных пациентов, госпитализированных с различным диагнозом.
Анализ содержания неоптерина в ликворе и сыворотке крови ВИЧ-инфицированных пациентов с различной этиологией поражения ЦНС продемонстрировал статистически значимые различия между исследованными группами для образцов ликвора (p=0,0185), но не для сыворотки крови (p=0,1993) (табл. 2).
Таблица 2. Содержание неоптерина (нмоль/л) в сыворотке крови и ликворе ВИЧ-инфицированных пациентов
| Биологическая жидкость | 1-я группа (основная группа — токсоплазмоз) n=22 | 2-я группа (группа сравнения — криптококкоз) n=15 | 3-я группа (контрольная группа — энцефалопатия) n 7 | p* |
| Ликвор | 63,84±41,45
65,35 (29,13—90,96) 10,89—137,88 | 88,68±32,1
94,46 (60,36—108,55) 35,24—138,56 | 40,27±25,96
31,65 (18,23—74,48) 12,36—74,48 | Н (критерий Краскела— Уоллиса)=7,98271 p=0,0185 р1, 3=0,642918 р1, 2=0,129528 р2, 3=0,023693 |
| Сыворотка крови | 9,1±2,64
8,98 (7,92—9,52) 5,84—19,31 | 11,51±5,97
9,03 (8,19—10,64) 7,26—27,53 | 8,59±2,46
7,66 (7,24—9,68) 6,47—13,7 | Н (критерий Краскела—Уоллиса)=3,226340 p=0,1993 р1, 3=0,992955 р1, 2=0,774898 р2, 3=0,241114 |
| p** | 0,0006555 | 0,000070 | 0,017961 | |
| Коэффициент корреляции Спирмена (R) | 0,909462 | 0,698539 | 0,071344 |
Примечание. В числителе: среднее значение±стандартное отклонение (M±SD), в знаменателе: медиана и интерквартильный диапазон Me; 25% квартиль — 75% квартиль, под дробью минимальное — максимальное значение ; * — различие между группами по Н-критерию Краскела—Уоллиса; ** — различие между группами по критерию Вилкоксона.
Известно, что неоптерин синтезируется преимущественно клетками макрофагально-моноцитарного ряда под действием гамма-интерферона [21, 22]. В ряде публикаций указывается, что его содержание может характеризовать интенсивность синтеза интерферона [29]. Высокие концентрации неоптерина сопровождают цитотоксический иммунный ответ, особенно характерный для острых вирусных инфекций [21, 22, 25].
Наиболее высокий уровень данного соединения в ликворе больных с грибковым поражением ЦНС отражает интенсивность тканевой воспалительной реакции и может расцениваться как признак воспалительной реакции в этой ткани [21, 29]. Более низкий уровень неоптерина у пациентов основной группы, возможно, обусловлен не только развивающейся иммуносупрессией на фоне СПИД, но и дополнительным иммуносупрессивным воздействием паразита, так как известно, что Toxoplasma gondii обладает собственным иммуносупрессивным эффектом на ткани организма хозяина [15, 16]. Наименьший уровень неоптерина у пациентов 3-й группы больных, вероятно, связан с тем, что неврологическая симптоматика, послужившая причиной госпитализации и проведенного обследования, связана не столько с воспалительным поражением ЦНС каким-либо инфекционным агентом из группы возбудителей оппортунистических инфекций, а обусловлена гибелью клеток ЦНС в результате цитотоксического воздействия вируса ВИЧ.
Для более точной диагностической и прогностической клинико-диагностической оценки концентрации неоптерина у ВИЧ-инфицированных пациентов с поражением ЦНС необходимы дальнейшие исследования концентрации неоптерина в биологических жидкостях, в том числе в ликворе, в динамике при различном течении заболевания.
Выводы
1. У пациентов с ВИЧ-ассоциированным поражением ЦНС в стадии СПИД уровень неоптерина в ликворе в 7,53 раза выше его содержания в сыворотке крови, что свидетельствует об активной продукции данного соединения клетками ЦНС.
2. Отсутствие корреляции между концентрацией неоптерина в сыворотке крови и ликворе указывает на незначительную проницаемость гематоэнцефалического барьера ЦНС для данного соединения
3. Различия уровня неоптерина в ликворе пациентов с ВИЧ-ассоциированным поражением ЦНС в стадии СПИД могут быть обусловлены этиологическим фактором.
Конфликт интересов. Авторы данной статьи подтвердили отсутствие финансовой поддержки/конфликта интересов, который необходимо обнародовать.
Финансирование. Исследование выполнено на средства гранта федерации лабораторной медицины (ФЛМ) по договору о предоставлении гранта от 11 декабря 2019 г. (протокол президиума ФЛМ от 25.06.19).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.