Хронические миелопролиферативные опухоли, или заболевания (ХМПЗ) являются результатом злокачественной трансформации миелоидных клеток [1]. В отличие от острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) в периферической крови пациентов с ХМПЗ преобладают морфологически дифференцированные клетки миелоидного ряда. Согласно современной классификации ВОЗ, к Ph-отрицательным ХМПЗ относятся истинная полицитемия (ИП), эссенциальная тромбоцитемия (ЭТ) и первичный миелофиброз [2]. К Ph-положительным ХМПЗ относится хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), при котором у большинства пациентов детектируется филадельфийская (Ph) хромосома — транслокация t (9;22) (q34; q11) и химерный транскрипт BCR-ABL. Около 85% пациентов с Ph-отрицательными ХМПЗ характеризуются наличием какой-либо из соматических мутаций в генах JAK2, CALR или MPL. Обнаружение этих мутаций позволило уточнить патогенез ХМПЗ, в основе которого лежит нарушение регуляции JAK-STAT-сигнального пути. На сегодняшний день известно, что у 6% пациентов с ИП и 5% с ЭТ в течение первых 10 лет с момента постановки диагноза наблюдаются прогрессия основного заболевания в миелофиброз (МФ). Исход в острый лейкоз наблюдается у 3—5% пациентов с ИП и ЭТ в течение первых 10 лет с момента диагностики, что характеризуется крайне неблагоприятным прогнозом и значительным уменьшением продолжительности жизни [3]. Вместе с тем на сегодняшний день нет достаточно ясного представления о механизмах прогрессии МФ и, как следствие, отсутствуют молекулярно-генетические методы определения риска и мониторинга прогрессии заболевания.

Злокачественная трансформация клеток зачастую сопровождается активацией генов раннего эмбриогенеза, что может служить удобным диагностическим маркером развития заболевания. Например, транскрипционный фактор WT1 (Wilms tumor protein), который играет важную роль в эмбриогенезе, регулируя процессы клеточной пролиферации и дифференцировки. Активная экспрессия WT1 также детектируется в клетках отдельных злокачественных опухолей.

В ряде исследований [4—6] было показано, что повышенная экспрессия гена WT1 сопровождается увеличением риска рецидива ОМЛ почти в 4 раза и может служить маркером прогрессии заболевания. Также опубликованы результаты, подтверждающие возможность использования показателя экспрессии данного гена и в качестве прогностического маркера для Ph-негативных ХМПЗ [7].

Недавно было установлено, что уровень экспрессии еще одного эмбрионального гена HMGA2 (High-mobility group AT-hook-2), продуктом которого является одноименный фактор транскрипции, значительно увеличен у пациентов с первично диагностированным ОМЛ и не снижается в случае последующего рецидива, что также может служить маркером негативного прогноза при ОМЛ [8]. Описаны данные в пользу участия HMGA2 в патогенезе миелоидной метаплазии [9]. В исследовании C.C. Chen и соавт. [10] показано, что экспрессия HMGA2 значительно увеличивается в гранулоцитах пациентов с первичным МФ.

Вместе с тем целенаправленного сравнительного исследования экспрессии WT1 и HMGA2 у пациентов с ХМПЗ ранее не проводилось.

Цель настоящего исследования — оценка диагностического и прогностического значения уровня экспрессии генов WT1 и HMGA2 при ХМПЗ.

В исследование включены 29 пациентов с ИП (в возрасте от 30 до 74 лет, 13 женщин и 16 мужчин), 16 пациентов с ЭТ (в возрасте от 26 до 79 лет, 10 женщин и 6 мужчин), 17 пациентов с диагнозом МФ (в возрасте от 47 до 79 лет, 10 женщин и 7 мужчин), 11 пациентов с ХМЛ (в возрасте от 39 до 82 лет, 9 женщин и 2 мужчин), 4 из которых находились на терапии 2-й линии, а также 28 здоровых добровольцев (в возрасте от 22 до 38 лет, 18 женщин и 10 мужчин), составляющих группу контроля. Все пациенты подписали стандартное информированное согласие. Для исследования использовали пробы венозной крови, которые сразу после взятия помещали в пробирку со стабилизатором РНК/ДНК (ООО «Формула гена», Россия) и хранили при –20 °C для дальнейшего исследования.

В 33 пробах пациентов с ХМПЗ дополнительно был исследован уровень CD34⁺-клеток в периферической крови с использованием проточного цитофлюориметра BD FACSCanto II (США). Для этого взятие крови осуществляли в пробирки с ЭДТА и анализ проводили не позднее чем через 2 ч. При иммунофенотипировании использовали антитела CD34-PE и CD45-FITC («BD», США). Процентное содержание CD34⁺-клеток рассчитывали по отношению к общему количеству лейкоцитов (CD45⁺).

Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica 12.0. Сравнение показателей между группами осуществляли с использованием непараметрического критерия Манна—Уитни, статистически достоверными считали отличия при уровне p<0,05. Для сравнения частот встречаемости использовали критерий χ². Корреляцию между количеством CD34⁺-клеток крови и экспрессией WT1 анализировали с помощью ранговой корреляции Спирмена.

В табл. 1 приведены

В контрольной группе мРНК гена WT1 в пробах венозной крови не детектировалась используемой диагностической системой, в то время как экспрессия гена HMGA2 варьировала от 0,01 до 0,21 отн. ед. Среди 12 обследованных пациентов с ХМЛ у 2 выявлена экспрессия гена WT1. При этом она составила 0,01 и 0,06 отн. ед., в то время как уровень BCR-ABL в этих пробах был 78,8 и 100% соответственно (резистентность к терапии). В остальных образцах, в которых уровень BCR-ABL составил от 0 до 23%, мРНК WT1 не выявлена, уровень экспрессии HMGA2 не превышал значений, характерных для группы контроля.

Значимой экспрессии генов WT1 и HMGA2 не наблюдали ни у одного из пациентов с ЭТ.

Среди 56 проб пациентов с ИП повышенная экспрессия HMGA2 выявлена всего в пяти пробах у 4 (14%) пациентов. Следует отметить, что у этих пациентов также отмечен более высокий эритроцитоз (+13%; p<0,05) по сравнению с пациентами, имеющими нормальный уровень экспрессии HMGA2.

У пациентов с МФ уровень мРНК HMGA2 был примерно в 4 раза выше по сравнению с группой контроля и остальными группами пациентов (см. рисунок).

У пациентов с МФ при повышенной экспрессии генов WT1 и HMGA2 имелось значимое (p<0,05) снижение количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов (см. табл. 2), что свидетельствует о более выраженном фиброзе костномозговой ткани.

Следует отметить, что среди пациентов с МФ с повышенным уровнем WT1 у 80% выявлялись циркулирующие CD34⁺-клетки в венозной крови, в то время как данная популяция клеток выявлялась лишь у 3,5% пациентов в отсутствие экспрессии WT1 (χ²=19,3; p<0,001).

Выявление повышенной экспрессии генов WT1 и HMGA2 не зависит от наличия отдельных соматических мутаций, встречающихся при ХМПЗ (см. табл. 2).

В норме WT1 экспрессируется в различных тканях и органах человека, особенно выраженно в гонадах и селезенке. Однако в костном мозге у здоровых людей экспрессия WT1 снижена, а в клетках периферической крови она практически не обнаруживается [7]. В нашем исследовании у здоровых людей в периферической крови сколько-нибудь значимой экспрессии WT1 не выявлено. При лимфоидных и миелоидных лейкозах и миелодиспластическом синдроме экспрессия этого гена в трансформированных клетках значительно увеличивается [5]. Известно, что высокий уровень экспрессии гена WT1 можно обнаружить в стволовых кроветворных клетках (CD34⁺), которые выявляются в периферической крови у большинства пациентов с МФ [11], но практически не выявляются у здоровых людей. В нашем исследовании экспрессия гена WT1 обнаружена только у пациентов с МФ и была ассоциирована с наличием CD34⁺-клеток в венозной крови (r=0,81; p<0,05). Снижение количества клеток периферической крови, выявленное у пациентов с МФ с повышенной экспрессией WT1, является несомненным признаком прогрессии заболевания, развития фиброза костного мозга и ухудшения прогноза. В настоящей работе впервые было показано, что уровень экспрессии другого эмбрионального гена — HMGA2 не повышается в хронической фазе ХМЛ и не связан с уровнем экспрессии BCR-ABL. Увеличение экспрессии WT1 при ХМЛ было описано ранее [12]. Вместе с тем в нашей работе в отличие от данного исследования в качестве источника выделения РНК использованы пробы венозной крови, а не костного мозга. Очевидно, именно с этим связано то, что мы обнаружили высокий уровень мРНК WT1 только у 2 из 12 пациентов с ХМЛ.

Ген HMGA2 кодирует негистоновый белок, который не имеет собственной транскрипционной активности, но может регулировать процесс транскрипции других генов [9]. HMGA2 не экспрессируется в здоровых тканях легких и прямой кишки человека, но обнаруживается в большом количестве у пациентов с опухолями, такими как колоректальный рак, рак легких и желудка, и связан с размером опухоли и плохим прогнозом [13—15]. K. Ikeda и соавт. [16] установили, что повышенная экспрессия HMGA2 может сопровождаться увеличением уровня транскриптов JAK2 и фосфорилированием STAT3, что увеличивает пролиферацию гемопоэтических стволовых клеток. По имеющимся данным [17], увеличенная экспрессия HMGA2 также вызывает у мышей пролиферацию гемопоэтических клеток и ингибирует их апоптоз. Эти данные могут объяснить более высокий уровень эритроцитов у пациентов с ИП при регистрации повышенного уровня мРНК HMGA2.

В нашем исследовании наибольшее число пациентов, у которых наблюдали повышенную экспрессию гена HMGA2, имели диагноз МФ, что согласуется с данными H. Oguro и соавт. [17], в исследовании которых обнаружено, что повышенная экспрессия HMGA2 сопровождается развитием фиброза костного мозга при экспериментальной патологии у мышей.

Хотя почти в половине случаев при МФ зарегистрировано одновременное повышение экспрессии WT1 и HMGA2, мы не наблюдали ее корреляции с количественными значениями клеток в периферической крови. Интересно, что у пациентов с увеличенным уровнем экспрессии только одного гена WT1 количество тромбоцитов было в 3 раза ниже по сравнению с теми, у кого была повышена экспрессия сразу двух генов. Очевидно, экспрессия этих двух генов может иметь независимое диагностическое значение. Так, повышение экспрессии только WT1 без увеличения HMGA2 является неблагоприятным признаком и может свидетельствовать о более быстро развивающемся фиброзе костного мозга. Вместе с тем диагностическое значение уровня мРНК WT1 и HMGA2 в качестве критерия оценки риска развития резистентности к терапии, прогрессии миелофиброза и лейкемизации требует дополнительного изучения.

В настоящей работе было продемонстрировано увеличение экспрессии генов WT1 и HMGA2 у пациентов с ХМПЗ, ассоциированное с показателями прогрессии заболевания и развития М.Ф. Активация каждого из генов WT1 и HMGA2, вероятно, имеет отдельное диагностическое значение при разных вариантах ХМПЗ: увеличение мРНК HMGA2 в большей степени ассоциировано с эритроцитозом при ИП, в то время как мРНК WT1 — с прогрессией МФ и развитием резистентности к терапии при ХМЛ.

Источники финансирования: бюджет проекта НИР Красноярского филиала ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России и ФИЦ КНЦ СО РАН. В работе было также использовано оборудование Сибирского Федерального Университета.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail:krashemcenter@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-3984-285X