Мутации гена филаггрина и полиморфизм генов цитокинов у сибсов с атопическим дерматитом

Нарушения кожного барьера, связанные с мутациями гена филаггрина, и дисбаланс иммунологических механизмов с формированием Th2-варианта иммунного ответа, ключевую роль в котором играют интерлейкины (IL)-4 и IL-13, рассматривают как основные предрасполагающие к атопическому дерматиту (АД) факторы [1]. При развитии хронического воспаления при АД определенную роль начинает играть Th1-путь воспаления с продукцией IL-12 и IL-18. При всем многообразии информации о роли генетических нарушений при АД возникают вопросы взаимосвязи современных патогенетических представлений и клинических проявлений заболевания у пациента. На наш взгляд, следующим этапом внедрения знаний о генетических нарушениях при мультифакторных заболеваниях является анализ реальных клинических ситуаций. В этом аспекте особенно интересен анализ информации о членах одной семьи, страдающих АД.

Цель исследования — оценка наличия мутаций в гене филаггрина, генетического полиморфизма в генах цитокинов и клинических проявлений заболевания у сибсов с АД.

Для оценки взаимосвязи клинической картины АД с наличием мутаций генов филаггрина и цитокинов проведен клинический и генетический анализ у 3 сибсов: это пациент 1 (мальчик 2005 года рождения), пациент 2 (мальчик 2013 года рождения), пациентка 3 (девочка 2009 года рождения), которые в течение 5 лет наблюдались у дерматолога.

Для генетического тестирования использовали буккальный эпителий. Забор материала производили ватной палочкой путем соскоба с внутренней поверхности щеки. Из образцов эпителия выделяли ДНК. Для определения статуса носительства мутаций гена FLG (rs61816761, rs558269137, rs138726443) и полиморфизма генов IL-13 (rs20541), IL-4 (rs2243250, VNTR), TNFA (rs1800629), IL-18 (rs187238) проводили ПЦР TaqMan на амплификаторе CFX96 Touch Real-Time PCR с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров и зондов, подобранных сотрудниками лаборатории фармакогеномики ИХБФМ СО РАН (табл. 1).

Таблица 1. Определяемые мутации гена филаггрина и полиморфизм генов интерлейкинов у сибсов с атопическим дерматитом

С помощью программного обеспечения CFX Maestro для расширенного статистического анализа данных расшифрованы результаты ПЦР.

Для оценки структурных характеристик эпидермиса в зависимости от наличия или отсутствия мутации гена филаггрина детям до лечения проведено ультразвуковое сканирование кожи в очаге АД и на окружающей коже с использованием аппарата Skinscanner DUB TPM с датчиком с частотой 75 МГц. Глубина сканирования — 4 мм, разрешающая способность — 21 мкм.

Пациенты получали комбинированную наружную терапию АД, включавшую 0,1% крем метилпреднизолона ацепоната (МПА) с керамидами в основе (Комфодерм К) по следующей схеме: 1 раз в день 7 дней, через день 2 нед 2 раза в неделю 14 дней), с 8-го дня лечения к терапии добавляли 0,03% мазь такролимуса 2 раза в день не менее 1 мес, далее 1 раз в день 1 мес. На всю кожу пациенты применяли эмоленты с физиологическими липидами омега 3-6-9 (Сенсадерм специальный крем) не менее 2 раз в день. Для оценки ответа на терапию проводили контрольный осмотр через 4 нед и 8 нед от начала лечения.

Впервые семья обратилась по поводу заболевания пациентки 3, когда ей было 5 лет, с жалобами на выраженную сухость кожи туловища и конечностей, зуд и высыпания на коже. АД развился с 3-летнего возраста и носил тяжелый характер (SCORAD 58). В это же время были активно осмотрены пациент 1 и пациент 2 (рис. 1а—1в). У пациента 1 были проявления АД средней степени тяжести (SCORAD 39). У пациента 2 проявлений АД не отмечено, но уже через 1 мес началось обострение заболевания (см. рис. 1г) легкой степени тяжести (SCORAD 11).

Рис. 1. Состояние кожи при первом обращении.

а — пациент 1 (9 лет); б — пациент 2 (2 года); в — пациентка 3 (5 лет); г — пациент 2 (3 года) — дебют АД.

В возрасте 5–9 лет у пациентов наблюдали тяжелое течение заболевания с однотипными клиническими проявлениями АД на коже лица (рис. 2а—2в), локтевых (рис. 3а—3в) сгибов и нижних конечностей (рис. 4а—4в), а также выраженный ксероз кожи. Индекс SCORAD при обострениях повышался до 60.

Рис. 2. Состояние кожи лица у сибсов в возрасте 5—9 лет.

а — пациент 1 (9 лет); б — пациент 2 (6 лет); в — пациентка 3 (5 лет).

Рис. 3. Состояние кожи локтевых сгибов у сибсов в возрасте 5—9 лет.

а — пациент 1 (9 лет); б — пациент 2 (6 лет); в — пациентка 3 (5 лет).

Рис. 4. Состояние кожи нижних конечностей у сибсов в возрасте 5—9 лет.

а — пациент 1 (9 лет); б — пациент 2 (6 лет); в — пациентка 3 (5 лет).

В возрасте 13 лет у пациента 1 сохранялись проявления АД, но выраженность воспаления и ксероза значительно уменьшилась (рис. 5а—5в).

Рис. 5. Состояние кожи пациента 1 в возрасте 13 лет.

а — кожа локтевого сгиба; б — кожа лица; в — кожа голеней.

Проведенное исследование на 3 мутации гена филаггрина показало наличие патогенной мутации rs138726443 (гетерозигота) у пациентов 1 и 2, отсутствие патогенной мутации у пациентки 3 и отсутствие двух других определяемых мутаций у всех сибсов (табл. 2).

Таблица 2. Результаты генетического тестирования сибсов с атопическим дерматитом на наличие мутаций гена филаггрина

Примечание. 1 — гомозита (норма/норма), 2 — гетерозигота (норма/мутация), знак минус — патологический эффект.

С учетом влияния мутаций гена филаггрина на структурные изменения эпидермиса всем пациентам проведено ультразвуковое сканирование кожи в очагах АД и на окружающей коже в области локтевых и коленных сгибов (табл. 3).

Таблица 3. Ультразвуковые характеристики эпидермиса кожи локтевых и подколенных сгибов сибсов с атопическим дерматитом

Из данных табл. 3 видно, что толщина и эхоплотность эпидермиса у пациентов носила индивидуальный характер, не выявлено значительных различий в ультразвуковых показателях состояния эпидермиса окружающей очаги АД кожи между сибсами с мутациями гена филаггрина и пациенткой 3 (рис. 6а—6в). Толщина эпидермиса в окружающей очаги коже варьировала от 74 до 86 мкм. В очагах АД в подколенной области эхоплотность эпидермиса у сибсов с мутациями составляла 0,8 от показателя окружающей кожи — в отличие от пациентки 3, у которой этот показатель был равен 1,16 от показателя окружающей кожи; но в очагах в области локтевых сгибов пациента 1 эхоплотность эпидермиса составляла 0,76 от показателя окружающей кожи, пациента 2 — 1,36 от показателя окружающей кожи, пациентки 3 — 0,78 от показателя окружающей кожи, что также показывает индивидуальность данных изменений.

Рис. 6. Сканограммы кожи вне очага АД на коже правого предплечья до начала терапии. Датчик 75 МГц, глубина сканирования 4 мм.

а — пациент 1 (13 лет); б — пациент 2 (6 лет); в — пациентка 3 (9 лет).

Следующий этап исследования включал анализ полиморфизма генов цитокинов (табл. 4).

Таблица 4. Результаты генетического тестирования сибсов с атопическим дерматитом на наличие полиморфизма генов цитокинов

По результатам генетического анализа установлен полиморфизм генов IL-4 и IL-13 у всех сибсов, кроме того, у пациентки 3 обнаружен полиморфзим гена IL-18. Все выявленные полиморфизмы ассоциированы с повышением продукции цитокинов.

Проведение иммунологического исследования на выявление специфической сенсибилизации у пациентов показало наличие у всех сибсов сенсибилизации к белкам коровьего молока, казеину, альфа-лактоглобулину, белку яйца, эпителию и шерсти собаки (класс 2 — умеренно увеличенный уровень — 0,70—3,49 МЕ/мл).

Проанализирован ответ на проактивную терапию у пациента 2 и пациентки 3. До начала терапии у пациента 2 в возрасте 6 лет (см. рис. 3б) отмечена тяжелая степень заболевания (SCORAD 60). Через 1 мес от начала лечения наблюдали (по представленным фото) значительное улучшение (рис. 7а), но через 2 мес из-за нарушения режима нанесения препаратов состояние кожи у ребенка несколько ухудшилось (см. рис. 7б), при этом отмечено уменьшение SCORAD до 21. Продолжение терапии привело к длительному улучшению состояния кожи.

Рис. 7. Состояние кожи локтевых сгибов у пациента 2 в возрасте 6 лет.

а — через 1 мес от начала терапии; б — через 2 мес от начала терапии.

До начала терапии у пациентки 3 в возрасте 5 лет было обострение АД тяжелой степени (SCORAD 58) (см. рис. 1в, 2в, 3в, 4в). Через 1 мес проактивной терапии состояние кожи улучшилось (рис. 8а, 8б) и SCORAD уменьшился до 29. Через 2 мес от начала лечения SCORAD составял 7, очаги АД практически полностью разрешились (см. рис. 8в, 8г). Важно отметить, что во время терапии у пациентки отмечено нечеткое выполнение рекомендованного режима нанесения препаратов, но перерывы не превышали 1 дня.

Рис. 8. Состояние кожи пациентки 3 в возрасте 5 лет.

а, в — локтевые сгибы через 1 мес и 2 мес терапии, б, г — запястья через 1 мес и 2 мес терапии.

Таким образом, ответ на проактивную терапию у сибсов с АД был одинаковым независимо от выявленных мутаций гена филаггрина и полиморфизма генов цитокинов.

Генетический полиморфизм — аллельные варианты генов, которые не являются самостоятельной причиной заболевания, но могут снижать компенсаторные возможности организма и выступать в роли факторов риска. При генетическом полиморфизме частота генотипа встречается более чем у 1% представителей популяции. Если же речь идет о мутациях, то эти изменения встречаются менее чем у 1% представителей популяции.

Мутации гена филаггрина рассматривают как один из механизмов формирования характерных изменений в коже при АД и ихтиозе. Наиболее значимыми считаются мутации R501X, 2282del14 и R2447X [2]. Изучение частоты мутаций гена филаггрина среди пациентов с АД показало, что АД — мультифакторное заболевание и дефицит филаггрина не является ведущим этиологическим фактором заболевания [3]. В нашем случае среди сибсов с выявленной мутацией гена филаггрина R2447X (rs138726443) с нуклеотидной заменой C>А (аминокислотная замена Arg2447) не обнаружено особенностей проявлений клинической картины по сравнению с сестрой без мутации гена филаггрина. Кроме того, проведение высокочастотного ультразвукового исследования кожи как в очагах АД, так и на окружающей коже (с учетом возможного влияния мутации гена филаггрина на развитие ксероза у данных пациентов) с акцентом на состояние эпидермиса не показало выраженных различий в показателях сонограммы у всех 3 детей из одной семьи.

Исследование полиморфизма генов IL-4/IL-13 у детей с атопическими заболеваниями и повышением уровня IgE сыворотки крови показало возможное взаимодействие между иммунным ответом по Th1- и Th2-вариантам, возможно опосредованное повышенной активностью IL-13 в генетическом варианте Arg130Gln (rs20541) [4]. Пример коэкспрессии IL-13, IL-5 и INFγ ряд авторов рассматривают как возможный результат межхромосомного взаимодействия [5]. В нашем исследовании обнаружен полиморфизм гена IL-13 у всех сибсов, при этом у пациентов 1 и 2 не обнаружено полиморфизма генов TNFA и IL-18, а у пациентки 3 также наблюдали полиморфизм гена IL-18, ассоциированный с увеличением продукции IL-18. В этом плане интересной является информация об ассоциации полиморфизма гена IL-18, в частности рассматриваемого нами генотипа rs187238 (–137G>C), с патогенезом псориаза, болезни Крона, ювенильного идиопатического артрита, очаговой алопеции [6]. В течение 5 лет наблюдения у пациентки 3 не отмечено эпизодов очаговой алопеции или проявлений, напоминающих псориаз, но с учетом возможности развития данных заболеваний у пациентов с АД в анамнезе [7, 8] будет представлять интерес дальнейшее динамическое наблюдение за состоянием кожи в данном случае. Помимо этого, предполагается роль полиморфизма гена IL-18 в развитии бронхиальной астмы [9], которой также не было у пациентки 3.

Полиморфизм IL-4 не был связан с общим уровнем IgE, но рассматривается как фактор, косвенно влияющий на аллергические нарушения, например как модификатор генов, определяющий тяжесть заболевания [5]. У всех сибсов в нашем наблюдении выявлен полиморфизм гена IL-4, заболевание протекало активно после 3-летнего возраста, при обострении носило тяжелый характер (SCORAD>50), наиболее тяжелое течение отмечено в возрасте 5—9 лет, но у пациента 1 (старшего среди сибсов) в возрасте 13 лет процесс также носил распространенный характер, хотя уже соответствовал средней степени тяжести. Все сибсы также имели специфическую сенсибилизацию к ряду белков педиатрической панели с умеренно увеличенным уровнем IgE.

Важным вопросом работы с пациентами является ответ на терапию. У пациентов этой семьи наблюдали быстрый положительный эффект на проведение комплексной терапии с использованием крема, содержащего 0,1% МПА с керамидами в основе (Комфодерм К), 0,03% мази, содержащей такролимус, и эмолентов с физиологическими липидами омега 3-6-9 (Сенсадерм специальный крем). Не замечено различий в достижении эффекта в зависимости от выявленных мутаций или полиморфизма генов.

Представленный клинический случай 3 сибсов одной семьи с тяжелым течением АД демонстрирует необходимость переосмысления полученных знаний о генетической предрасположенности к заболеванию и влиянии на его развитие различных мутаций и полиморфизма генов, выявленных в крупных популяционных исследованиях, в приложении к конкретным клиническим ситуациям. И в этом плане большое значение имеет длительность наблюдения за пациентами, так как в разные возрастные периоды заболевание протекает с разной активностью. Например, в нашем клиническом случае сравнение течения заболевания у сибсов стало возможно только при ретроспективном анализе ситуации. Важное значение в этом направлении играют клинические фотографии и оценка дерматологических индексов, которые позволяют сохранить полученные данные на протяжении ряда лет и способствуют объективной оценке развития клинической картины.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — И.Г. Сергеева

Сбор и обработка материала — И.Г. Сергеева, Д.А. Микаилова, М.С. Новикова, Н.В. Кох

Написание текста — Д.А. Микаилова, И.Г. Сергеева

Редактирование — И.Г. Сергеева

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors’ contributions:

The concept and design of the study: I.G. Sergeeva

Collecting and interpreting the data: I.G. Sergeeva, D.A. Mikailova, M.S. Novikova, N.V. Kokh

Drafting the manuscript: D.A. Mikailova, I.G. Sergeeva

Revising the manuscript: I.G. Sergeeva

The authors declare no conflicts of interest.