В настоящее время татуировки получают все большее распространение в популяции, являясь элементом самовыражения, и/или причастности к определенной субкультуре, или статуса в иерархической лестнице. Наиболее часто для выполнения татуировок применяют синий и черный пигменты, которые в своем составе содержит оксид железа, углерод, измельченную древесину кампешевого дерева Haema-toxylum campechianum — источника красильного вещества кампеша, или синего сандала, а также сажу, полученную в результате неполного сгорания углеводородов, которая в качестве примесей содержит полиароматические углеводороды (ПАУ) [1].

Несмотря на то что пигментные красители через кожу вводятся непосредственно в организм человека и таким образом к ним должны предъявляться требования как к фармацевтическим препаратам, пигменты не проходят обязательного сертификационного контроля перед использованием. В то же время ПАУ, неизменно входящие в состав черного красителя, обладают доказанным токсическим, мутагенным и канцерогенным действием, а также могут поглощать УФ-излучение и генерировать цитотоксический синглетный кислород, нарушающий целостность кожных покровов [1—3].

В доступной литературе имеются данные о накоплении пигмента в коже и возникновении патологических процессов в ответ на проведение процедуры татуажа [4—6]. Описанный нами ранее клинический случай возникновения красного плоского лишая в области татуировки свидетельствует не только о местном воздействии татуажа на кожный покров, но и о системном [7].

Выбор в качестве объекта исследования лимфатических узлов обусловлен барьерно-фильтрационной и депонирующей функциями, выполняемыми в составе лимфатической дренажной системы организма. Кроме того, именно в лимфатическом узле происходит первичный контакт антигена с иммунокомпетентными клетками, что дает возможность рассматривать его как эффекторное звено иммунной системы [8—10]. В литературе есть сведения об обнаружении пигментов и продуктов их распада в лимфатических узлах, расположенных вблизи татуировки [11—13], что свидетельствует о непосредственном контакте татуировочных пигментов с иммунной системой. Однако имеющиеся сведения единичны и противоречивы, что обусловливает актуальность данного исследования.

Цель — выявить динамику морфологических изменений в коже и лимфатических узлах в ответ на введение татуировочного пигмента.

Исследование выполнено в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 и Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в других научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.) [14, 15]. В качестве экспериментальных животных были использованы 15 нелинейных половозрелых крыс-самцов массой 280—320 г (n=15). Под общим обезболиванием после обработки операционного поля крысам выполнялся татуаж посредством внутримы-шечного введения золетила (8,0 мг/кг) в сочетании с подкожным введением атропина сульфата 0,1% раствор (0,01 мл/100 г) с использованием роторной тату-машинки Long Time Liner. Выбор роторных машинок является принципиальным, так как в отличие от высокотравматичных индукционных аппаратов, применяемых для выполнения классических татуировок, роторные машинки обеспечивают щадящий режим работы и меньшую глубину проникновения в ткань (0,5 мм против 1,5—2 мм у индукционных). Широкая линейка цветовых пигментов, применяемых в настоящее время при татуаже, требует детального исследования местной и системной реакции организма в каждом конкретном случае, в зависимости от цвета и состава красителя. В связи с этим на первом этапе нашего экспериментального исследования мы выбрали пигмент черного цвета, который был введен крысам внутрикожно в область спины на площади 20 см², что составило 1/7 от общей площади тела животного (рис. 1).

Выведение животных из эксперимента проводили на 7-е, 30-е и 90-е сутки после процедуры. Осуществлен забор 60 фрагментов кожи с татуировкой и 45 близлежащих (подмышечных) лимфатических узлов, в качестве контроля использовали 20 фрагментов кожи и 15 регионарных лимфатических узлов интактных животных. Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24 ч, затем проводили по спиртам восходящей концентрации: 70—80—96—100° и хлороформу, заливали в парафин, изготовляли гистологические срезы, окрашивали их гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону [16].

Морфометрический анализ лимфатических узлов и подсчет клеточных структур был выполнен с использованием световой микроскопии в соответствии со сложившимися принципами количественных морфологических исследований [17, 18]. С помощью программы Видеотест Морфо определяли объемные доли (ОД) капсулы и трабекул, коркового вещества, мозгового вещества, корково-медуллярный индекс, процент первичных лимфатических узелков, процент вторичных лимфатических узелков, фолликулярный индекс, больший и меньший диаметры лимфатического узелка (D_max, D_min) и его герминативного центра (d_max, d_min). Цитоструктуру лимфатических узлов исследовали с использованием масляной иммерсии и морфометрической сетки (с шагом 10 мкм), которую вмонтировали в окуляр микроскопа (ув. 10×90) с подсчетом малых лимфоцитов, средних лимфоцитов, ретикулярных клеток, макрофагов, нейтрофилов и дегенеративно измененных клеток, подвергшихся некрозу и/или апоптозу.

Микрофотографии сделаны с использованием микроскопа Leiсa DM 100 с цифровой фотокамерой. Статистическая обработка проводилась непосредственно из общей матрицы данных Exсel 7.0 («Microsoft», США) с привлечением возможностей программы Statgraph 5.1 («Microsoft», США). Вычисляли средние величины количественных показателей и стандартные ошибки (M±m), достоверность различий выборок оценивали по критерию Стьюдента (t), и соответствующему ему показателю достоверности (р). Статистически значимыми различия считали при р<0,05.

При гистологическом исследовании кожа интактных крыс имела типичное строение, эпидермис был представлен роговым слоем из кератиноцитов, зернистого слоя, состоящего из нескольких слоев клеток, шиповатого слоя с неровными клетками, уплощенными по направлению к наружному слою, и базальным слоем, клетки которого плотно прилегали к базальной мембране (рис. 2, а).

При гистологическом исследовании образцов кожи экспериментальных животных на всех сроках эксперимента установлено, что в эпидермисе в области тату сохранялись все слои. Эпидермис был представлен базальным слоем, в клетках которого определялось умеренное количество митозов, шиповатым слоем, слоем зернистых клеток, содержащих значительное количество эозинофильных гранул, располагающихся на границе с роговым слоем, где кератиноциты образовывали чешуйки. Однако на 7-е сутки после выполнения татуировки отмечалось неравномерное распределение пигмента непосредственно под эпидермисом — как отдельными гранулами, так и «пылевидным» распределением в сосочковом слое дермы. Волокна данного слоя были представлены рыхлой соединительной тканью с признаками отека (рис. 3, а).

Накопление красящего пигмента наблюдалось в поверхностных слоях кожи, в частности в сосочковом слое дермы, преимущественно периваскулярно. Сосуды дермы были неравномерного кровенаполнения, отмечалось краевое стояние лейкоцитов в сосудах, что свидетельствовало о развитии воспалительной реакции в ответ на микроповреждения дермы. Прилежание эпидермиса к сосочковому слою дермы было различным в зависимости от выраженности оте-ка кожи, в отдельных участках были отмечены «пустоты» между базальным слоем эпидермиса и собственно дермой. В более глубоких слоях дермы (в сетчатом слое) отмечалась очаговая лейкоцитарная инфильтрация, представленная в основном нейтрофилами с единичными эозинофилами и лимфоцитами (рис. 3, б).

По мере увеличения сроков после выполнения татуировки (на 30-е сутки) явления отека и острого воспаления уменьшались наряду с перераспределением пигмента из сосочкового слоя дермы в сетчатый слой. Так, наблюдались единичные мелкие гранулы пигмента в сосочковом слое дермы, которые располагались диффузно. Выявлялись вакуольная дистрофия клеток эпидермиса непосредственно вблизи скоплений татуировочного пигмента, массивное накопление черного пигмента в сосочковом слое дермы, в зоне татуировки определялись участки гиперкератоза (рис. 3, в).

Волокна сосочкового слоя дермы располагались достаточно плотно друг к другу, были утолщены и при окраске гематоксилином и эозином были представлены гомогенными эозиновыми массами, что может свидетельствовать об очаговом развитии гиалиноза (рис. 3, г).

На 90-е сутки основные морфологические изменения наблюдались со стороны собственно дермы. Пигментный краситель накапливался преимущественно в сосочковом слое дермы, достигая в некоторых случаях концевых отделов сальных желез. Скопления пигмента наблюдались между придатками кожи, где присутствовало большое количество макрофагов, в цитоплазме которых выявлялись гранулы черного цвета. При этом основная масса красителя располагалась свободно среди волокон соединительной ткани, визуализировались единичные лим-фоциты, отмечалось обилие кровеносных сосудов умеренного кровенаполнения (рис. 3, д).

Наблюдалось накопление пылевидных частиц в клетках эпидермиса преимущественно базальных слоев, что свидетельствовало об активации клеток Лангерганса, также относящихся к системе мононуклеарных фагоцитов. Кроме того, выявлялись отдельные клетки волосяных фолликулов, содержащие гранулы черного цвета, что, вероятно, обусловлено способом введения краски и попаданием ее в полость волосяного фолликула. Наряду с обильным накоплением пигмента в сосочковом слое отмечались вакуолизация клеток базального слоя с пикнотическими ядрами, участки гиперкератоза, что влияет на способность эпидермиса к регенерации. Митозы клеток базального слоя были единичны.

Волокна соединительной ткани были резко утолщены, представлены гомогенными эозиновыми массами (гиалиноз), с последующим формированием келоида. Сосуды были обычного кровенаполнения.

При окраске по Ван-Гизону наибольшее количество пигмента отмечено среди волокон рыхлой волокнистой ткани, в то время как среди коллагеновых волокон плотной неоформленной соединительной ткани выявлялись единичные гранулы (рис. 3, е).

Регионарные лимфатические узлы интактных животных снаружи были покрыты тонкой соединительнотканной капсулой, с незначительным количеством клеточных элементов и четко визуализируемым корковым и мозговым веществом. Корковое вещество представлено лимфоидными фолликулами, образованными скоплением лимфоцитов. Определяются герминативные центры, включающие крупные клетки — центробласты, зрелые центроциты, а также плазматические клетки и единичные макрофаги (рис. 4).

Паракортикальная зона содержала лимфоциты, клетки ретикулума, единичные островки плазмоцитов, расположенные между лимфоидными фолликулами. В мозговом веществе определялись трабекулы, плазматические клетки, лимфоциты и макрофаги. Синусы, представленные коллагеновыми волокнами с незначительным количеством клеток рыхлой со-единительной ткани, были не расширены.

Регионарные лимфатические узлы животных с татуировкой макроскопически отличались от таковых в группе интактных крыс. Выделенные подмышечные лимфатические узлы на всех сроках эксперимента были увеличены в размерах и имели черный цвет, обусловленный накопленным в них черным татуировочным пигментом (рис. 5).

При микроскопическом изучении регионарных лимфатических узлов у крыс опытной группы на всех сроках эксперимента определялись утолщение капсулы, расширение синусов. При гистологическом исследовании ткани лимфатических узлов было установлено, что основное накопление пигмента происходило по ходу синусов. Так, лимфатический узел был покрыт соединительнотканной капсулой, от которой внутрь отходили трабекулы. В подлежащей ткани располагался краевой синус, вокруг которого наблюдалось накопление пигмента черного цвета. В дальнейшем через промежуточные синусы отток лимфы проходил в синусы мозгового вещества, по ходу которых также наблюдалось накопление пигмента.

Граница между корковым и мозговым веществом просматривалась недостаточно четко за счет выраженной диффузной инфильтрации пигментом черного цвета. Однако в корковом веществе определялись фолликулы с нечетко выраженным герминативным центром. По клеточному составу в фолликулах определялись лимфоциты, плазмоциты и единичные макрофаги. В зародышевом центре присутствовало незначительное количество пигмента, расположенного по периферии. В мозговой части узла определялись тяжи клеток и синусоиды, среди которых происходило накопление пигмента. Морфологические изменения ткани лимфатического узла проявлялись в первую очередь накоплением пигмента в клетках ретикулоэндотелиальной системы, расположенных как очаговыми скоплениями, так и диффузно. На 7-е сутки после татуировки цитоархитектоника органа сохранялась, однако были отмечены выраженное утолщение капсулы лимфатического узла, расширение субкапсулярных и мозговых синусов, сопровождающиеся гистиоцитарной реакцией. Обнаруживалось увеличение мантийной зоны за счет лимфоидных фолликулов, количество которых возрастало параллельно с увеличением их размеров. В перикортикальной зоне отмечено увеличение количества гистиоцитов и плазмоцитов, что косвенно свидетельствует об активации гуморального звена иммунитета. По всему узлу определялись крупные клетки, по-видимому, макрофаги, нагруженные татуировочным пигментом, с явлениями незавершенного фагоцитоза. Определялись единичные участки некроза в перинодулярной области с выраженной лейкоцитарной инфильтрацией, свидетельствующие о развитии воспаления. На 30-е сутки эксперимента общая картина морфологических изменений в лимфатическом узле сохранялась, вокруг некротизированных участков формировалась грануляционная ткань различной степени зрелости, определялось значительное количество свободно расположенных гранул татуировочного пигмента.

К окончанию эксперимента (90-е сутки) определялись макрофаги, накапливающие пигмент черного цвета, которые располагались как в корковом веществе лимфатического узла, так и в его мозговой части. Кроме того, часть клеток, расположенных рядом с синусоидами, содержала единичные гранулы черного цвета (рис. 6).

Обращало на себя внимание умеренное обеднение клеточными элементами ткани лимфатического узла. Несмотря на отсутствие выраженного воспаления, присутствовали реактивные изменения, которые выражались в увеличении близлежащих к пигменту лимфоидных фолликулов. Со стороны микроциркуляторного русла выявлен умеренный гиалиноз сосудов.

Результаты морфометрического исследования лимфатических узлов представлены в табл. 1.

Независимо от срока эксперимента выявлено достоверное увеличение объемной доли капсул и трабекул, максимально на 30-е сутки (в 2,21 раза), по сравнению с группой интактных животных (p<0,05). Выявлено умеренное уменьшение объемной доли мозгового вещества, минимальные значения которой установлены на 30-е сутки эксперимента (в 2,1 раза меньше, чем в интактной группе).

Увеличение корково-медуллярного индекса у крыс исследуемых групп произошло за счет расширения коркового слоя лимфатического узла (на 30-е сутки в 1,26 раза), что согласуется с результатами гистологического исследования (p<0,05). Количество первичных лимфатических узелков возросло в 1,41 раза и было максимальным на ранних сроках эксперимента (7-е сутки) параллельно с увеличением их диаметра по сравнению с животными без татуировки (в 1,21 раза; p<0,05).

Кроме этого, у крыс опытной группы отмечено достоверное увеличение максимального и минимального диаметров герминативного центра, при этом наибольшие значения данных показателей определялись на 7-е и 30-е сутки после процедуры татуажа (p<0,05). На поздних сроках эксперимента (90-е сутки), напротив, диаметры лимфатических узелков и герминативных центров уменьшались, что свидетельствовало о вовлеченности регионарных лимфатических узлов в патологический процесс, что согласуется с данными литературы [9, 19].

Результаты, полученные при цитоморфометрии ткани лимфатических узлов у крыс исследуемых групп, представлены в табл. 2.

Представленные данные свидетельствуют об активном ответе клеточного звена иммунитета на презентированный антиген в виде татуировочного пигмента. На ранних сроках эксперимента (7-е сутки) происходило увеличение числа активных лимфоцитов в 2,78 раза по сравнению с группой интактных животных (p<0,05). Зарегистрированное максимальное количество больших лимфоцитов (231,75±21,83 клетки/мкм²) умеренное количество средних на фоне уменьшения в ткани лимфатического узла малых лимфоцитов (до 987,85±27,16 клетки/мкм²) представляется вполне логичным, так как при первичном взаимодействии с антигеном в виде татуировочного пигмента происходит активная трансформация малых неактивных лимфоцитов в большие лимфоциты. Количество макрофагов увеличивалось на 7-е сутки и было максимальным на 30-е сутки после выполнения татуажа, превышая таковой показатель в интактной группе в 4,31 раза (p<0,05). К окончанию эксперимента (90-е сутки) по-прежнему число макрофагов было достоверно больше, чем у крыс без татуировки, при этом до 1/3 из них содержали гранулы татуировочного пигмента.

Количество нейтрофилов было максимальным на 7-е сутки, в этот же срок обнаружено самое большое число клеток с признаками дегенеративных изменений, подвергшихся некрозу и/или апоптозу. По мере продолжительности эксперимента на 30-е сутки количество нейтрофилов снижалось, однако и по окончании эксперимента их число превышало данный показатель в интактной группе в 6,22 раза (p<0,05), что свидетельствует о продолжающемся воспалительном процессе. Число дегенеративно измененных клеток также уменьшалось, что, по-видимому, связано с их утилизацией посредством апоптоза, и на 90-е сутки количество поврежденных клеток составило 24,63±4,95 клетки/мкм², превышая таковой показатель в группе интактных крыс в 1,8 раза (p<0,05). Полученные данные при подсчете абсолютного количества клеток в ткани лимфатического узла полностью согласуются с данными морфометрического исследования лимфатического узла по срокам и направленности выявленных изменений.

Таким образом, в исследовании установлено, что процедура татуировки сопровождается накоплением пигментного красителя не только в коже, но и в регионарных лимфатических узлах, что связано с распространением пигмента лимфогенным путем и свидетельствует о системном воздействии.

Впервые показаны морфофункциональные изменения в коже и лимфатических узлах в ответ на введение татуировочного пигмента в динамике. Установлено, что на ранних сроках после процедуры татуажа изменения в коже и ткани лимфатических узлов харак-теризуются явлениями острого воспаления, сопровождающимися гибелью клеток в результате некроза и лейкоцитарной инфильтрацией. Параллельно с этим выявлены признаки заинтересованности клеточного звена иммунитета, выражающиеся в увеличении количества и активации лимфоцитов и макрофагов. В отдаленные сроки после выполнения татуировки морфофункциональные изменения со стороны кожи проявлялись в виде накопления пылевидных частиц в клетках эпидермиса (преимущественно базальных слоев), что свидетельствовало об активации клеток Лангерганса, также относящихся к системе мононуклеарных фагоцитов, и в виде формирования участков гиперкератоза в зоне татуировки. Со стороны регио-нарных лимфатических узлов сохранялись явления гранулематозного воспаления вокруг инородных тел (гранулы пигмента), количество нейтрофилов по-прежнему было увеличенным, определялось значительное число макрофагов, в том числе нагруженных татуировочным пигментом, на фоне умеренного снижения активных лимфоцитов. Уменьшение объемной доли мозгового слоя лимфатических узлов в течение всего эксперимента косвенно свидетельствовало об уменьшении количества плазматических клеток, продуцирующих иммуноглобулины, а следовательно, об угнетении гуморального звена иммунитета.

Итак, в результате комплексного гистологического, цитологического, морфометрического исследований в динамике показано, что при выполнении татуировок происходят выраженные изменения как со стороны кожи непосредственно в зоне татуажа, так и со стороны регионарных лимфатических узлов. Полученные данные свидетельствуют о вовлечении лимфатических узлов как органов иммунной системы и формировании иммунного ответа на введение татуировочного пигмента и не противоречат имеющимся в литературе сведениям о заинтересованности лимфатических узлов как эффекторного органа иммунной системы при выполнении татуажа [9, 20].

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — О.Н. Карымов, А.А. Воробьев, С.А. Калашникова

Сбор и обработка материала — О.Н. Карымов, С.А. Калашникова, Л.В. Полякова

Статистическая обработка данных — Л.В. Полякова

Написание текста — О.Н. Карымов, С.А. Калашникова

Редактирование — А.А. Воробьев

Authors’ contributions:

The concept and design of the study — O.N. Karymov, A.A. Vorobev, S.A. Kalashnikova

Collecting and interpreting the data — O.N. Karymov, S.A. Kalashnikova, L.V. Polyakova

Statistical analysis — L.V. Polyakova

Drafting the manuscript — O.N. Karymov, S.A. Kalashnikova

Revising the manuscript — A.A. Vorobev

Сведения об авторах

Карымов О.Н. — https://orcid.org/0000-0002-7048-3605

Воробьев А.А. — https://orcid.org/0000-0001-8378-0505

Калашникова С.А. — https://orcid.org/0000-0002-7688-9366

Полякова Л.В. — https://orcid.org/0000-0002-5349-1435

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Карымов О.Н., Воробьев А.А., Калашникова С.А., Полякова Л.В. Морфофункциональные изменения в коже и лимфатических узлах в ответ на ведение татуировочного пигмента: экспериментальное исследование. Клиническая дерматология и венерология. 2019;18(4):-500. https://doi.org/10.17116/klinderma201918041

Автор, ответственный за переписку: Калашникова С.А. —
e-mail: kalashnikova-sa@yandex.ru