Введение
Терминальные стадии заболеваний печени — одна из основных причин смерти во всем мире. Единственной альтернативой является трансплантация донорской печени. Хирургические вмешательства на печени выполняют по все более широким показаниям, в связи с этим необходимо еще лучше понимать анатомию и физиологию этого органа [1].
Печень млекопитающих обладает исключительной способностью к компенсационному росту в ответ на физические, инфекционные или токсические воздействия, которые вызывают потерю клеток. Восстановление печени — жестко регулируемый процесс, гипертрофия и гиперплазия проходит с участием различных пулов клеток органа и с тонко настроенным взаимодействием факторов роста, цитокинов, компонентов экстрацеллюлярного матрикса и других регуляторов [2].
Цель исследования — на основании анализа данных литературы изучить особенности регенерации печени после резекции в клинике и эксперименте.
Регенерация печени после резекции
Скорость регенерации печени субъективно, по словам доноров, значительно различалась в зависимости от их возраста, типа и размера трансплантата [3]. На скорость регенерации не влияет формирование послеоперационного желчного свища, но установлена зависимость от размеров остающегося фрагмента органа [4]. По мнению T. Aoki и соавт. [5], резекция печени у людей сопровождается быстрой регенерацией в первые 3 мес, после чего следует более умеренное восстановление. Однако объем печени полностью не восстанавливается до предоперационного даже спустя 4 года после резекции.
В ответ на повреждение печеночные клетки, особенно гепатоциты, могут быстро пролиферировать для восстановления объема органа. При определенных обстоятельствах резидентные клетки печени с возможностями предшественников участвуют в пролиферации и дифференцировке других клеточных элементов органа. Эти клетки-предшественники, известные как овальные клетки, у грызунов содержатся в каналах Геринга, расположенных в перипортальной области [6].
Частичная (70%) гепатэктомия выполнена у 64 крыс. Состояние животных изучали на 1—8-й день после операции. Как масса печени, так и скорость регенерации представляли восходящую кривую с максимумом в 1—4-й день после операции и выходом на плато в течение 5—6 сут. Пролиферация гепатоцитов (количество Ki-67+-клеток на 1 мм2 площади среза) была максимальной (250 гепатоцитов/мм2) на 1—3-й день после резекции и сокращалась к 5-му дню [7]. Согласно данным K. Schleimer и соавт. [8] после такой же операции у крыс масса органа увеличивалась непрерывно до 529±30% через 6 нед. Со 2-го дня после операции наблюдали значительное увеличение пролиферативной активности гепатоцитов (301±126 Ki-67+-клеточных элементов в 10 полях зрения).
Регенеративный ответ возникает независимо от объема резекции, но ход регенерации и экспрессия факторов роста различаются в зависимости от объема удаленной паренхимы [9]. При большем объеме резекции число гепатоцитов, входящих в митогенный клеточный цикл, который поддерживает быструю регенерацию печени, значительно выше [10]. Субтотальная (90%) резекция неизменно приводит к смерти крыс без включения регенерации. У крыс с низкой (10%) остаточной массой печени после резекции обнаружено сохраняющееся повышение уровня интерлейкина-6, фактора роста гепатоцитов (HGF) и трансформирующего фактора роста (TGF)-b1 в крови, что связано с отсутствием пролиферации [2].
У мышей регенеративный ответ печени также зависит от количества удаленной ткани. Через 1 нед все животные после резекции 70% печени были живы, а после резекции 90% — погибли. Число Ki67+-гепатоцитов увеличивается сразу после удаления 70% объема, но этого не отмечено после резекции 90% паренхимы [11].
Методом световой микроскопии изучали особенности регенерации печени после резекции части ее доли у крыс. Даже спустя 5 нед после удаления 10% органа у некоторых крыс вследствие сосудистых расстройств и нарушений оттока желчи продолжаются активные процессы повреждения и склероза оперированной доли, которые могут завершиться ее атрофией или фиброзом [12].
Регенерация печени после резекции коррелирует с развитием фиброза. Переход покоящихся печеночных звездчатых клеток в фиброгенные миофибробласты сопровождается не только фиброзированием. Некоторые из этих клеточных элементов становятся предшественниками, обеспечивающими регенерацию эпителиальных структур печени после удаления ее части. Следовательно, формирование соединительнотканных и фиброзных рубцов является необходимым компонентом успешной регенерации печени [13].
Таким образом, на повреждение печень отвечает не восстановлением утерянных участков, а гипертрофией оставшейся паренхимы. Существует предел в объеме резекции печени. У млекопитающих он составляет около 70% от массы органа, при превышении этого предела развивается печеночная недостаточность, часто приводящая к гибели оперированного. Регенерация печени после удаления фрагмента протекает с различной скоростью, на что главным образом влияет объем резецированного участка. Пролиферативная активность гепатоцитов после повреждения паренхимы возрастает во всем органе независимо от расположения относительно места хирургического вмешательства. После резекции печени пристальное внимание следует обращать не только на восстановление функционально активной паренхимы, но и на регенерацию непаренхиматозных структур — сосудистой сети и желчных протоков.
Влияние на регенерацию резецированной печени различных факторов
Регенерация печени после резекции проходит значительно медленнее у пациентов с предварительным ее поражением (22 пациента с хроническим вирусным гепатитом и гепатоцеллюлярной карциномой), чем у больных с нормальной печенью (18 пациентов с метастазами в печень колоректального рака) [14].
Аналогичные результаты получены другими исследователями. У пациентов с хроническим гепатитом и циррозом восстановление печени после операций по поводу первичного и вторичного рака идет медленнее, чем у больных при таком же опухолевом процессе, но без сопутствующих заболеваний. Обширная резекция печени с цирротическими изменениями часто приводит к печеночной дисфункции и угрожающей жизни полиорганной недостаточности. В печени во время индуцированного CCl4 цирроза активирован апоптоз, который может участвовать в нарушениях регенеративных процессов, наблюдаемых при этом заболевании [15—17].
Экспериментаторы [18] оценивали последствия ежедневного незначительного (1 г/кг), умеренного (2 г/кг) и тяжелого (4 г/кг) воздействия этанола на регенеративную активность печени у крыс. Взрослым самцам ежедневно вводили этанол и водопроводную воду (контроль) через зонд в течение 30 дней до удаления 70% объема печени. Результаты показали, что незначительное потребление этанола усиливает регенеративную активность печени после обширной резекции.
Для успешной регенерации печени требуется адекватное функционирование печеночных макрофагов. Численность и миграция макрофагов регулируются макрофагальным колониестимулирующим фактором. Уровень этого фактора в плазме крови возрастает у пациентов пропорционально объему резекции печени, низкое содержание данного цитокина связано с повышенной смертностью [19].
HGF (фактор роста гепатоцитов), впервые идентифицированный как наиболее сильный стимулятор синтеза ДНК в гепатоцитах, не только стимулирует регенерацию печени, но и улучшает ее функции, облегчает течение фиброза и защищает клетки от повреждения. Кроме того, HGF в значительной мере подавлял пострезекционные дисфункции печени у крыс. И самое главное, лечение HGF заметно улучшило выживаемость животных в течение 48 ч после 70% резекции [16].
На регенерацию печени оказывают влияние различные внешние и внутренние факторы. В связи с этим появляется возможность активного управления репарационными процессами. Сопутствующие патологические процессы, такие как онкологические заболевания, вирусные поражения, цирроз различной этиологии, замедляют восстановление печени после резекции. Является перспективным использование различных цитокинов не только для активации, ускорения восстановления печени, но и при необходимости для замедления этого процесса.
Клеточные технологии в регенерации поврежденной печени
Поскольку проблемы пересадки органов решены не полностью, клеточная терапия появилась в качестве нового эффективного способа лечения, который основан на способности мультипотентных стромальных клеток (МСК) к мультилинейной дифференцировке и хомингу (процесс перемещения свободных клеток к тканям-мишеням) в поврежденные ткани. Исследования МСК показывают, что клеточные технологии являются потенциальной альтернативой трансплантации печени [20, 21].
Традиционно признано, что МСК при печеночной недостаточности оказывают терапевтическое действие в основном благодаря трансдифференцировке в различные клеточные элементы. Вместе с этим широко используют возможность МСК секретировать различные трофические и иммуномодуляторные факторы, а также экстрацеллюлярные везикулы (экзосомы), которые обладают сходным лечебным действием с самими МСК [20].
В настоящее время существует 2 направления в биоинженерии и регенерации печени. Первое состоит в создании поддерживающего каркаса, либо синтетического, либо из децеллюляризованных органов человека или животных. Далее на этом каркасе размещают клетки, которые созревают в биореакторах или in vivo. Эта стратегия, по-видимому, предлагает самый быстрый путь к клиническому применению. Второе направление связано с индуцированием регенерации оставшейся после резекции ткани через манипулирование клеточным циклом [21].
МСК трансфицировали (вводили невирусным методом) фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и использовали их, вводя через портальный тракт, для регенерации печени крыс после резекции 70% объема органа. Уровень экспрессии VEGF, фактора роста фибробластов, фактора роста тромбоцитов, эпидермального фактора роста, трансформирующего фактора роста TGF, HGF, ангиопоэтинов 1 и 2 в оставшейся ткани печени был значительно выше после инъекции МСК или МСК с трансфицированным VEGF. Обнаружены значительные различия массы и объема печени на 14-й день у крыс без клеточной терапии и у крыс после применения МСК с VEGF. За исключением перипортальной воспалительной реакции, все гистологические параметры были лучше после использования МСК или МСК с VEGF. Сделано заключение, что МСК, трансфицированные VEGF, после инъекции в портальную вену на фоне резекции печени встраиваются в орган и усиливают пролиферацию клеточных элементов желчных протоков и гепатоцитов. При этом секретируются указанные ростовые факторы, которые посредством паракринного действия поддерживают функцию печени, ее регенерацию, восстановление объема и массы [22].
На модели резекции печени у мышей изучали эффективность использования для влияния на регенерацию МСК, выделенных из печени мышиных эмбрионов. Этими клетками в виде мембраны закрывали резецированную поверхность, при этом быстро восстанавливались масса и функция печени с экспрессией трансмембранных сиаломуцинов, активацией фибринолитической системы и синтезом факторов роста гепатоцитов. Применение аллогенных МСК было столь же эффективным, как и сингенных [23].
МСК адипогенного и костномозгового происхождения культивировали на матрицах из фиброина шелка с последующим размещением на поверхности печени мышей после моделирования острого повреждения тетрахлорметаном. Использование МСК показало хорошие результаты биосовместимости с фиброином, они активно дифференцировались в гепатоцитоподобные клетки in vitro. Кроме того, на таких матрицах в модели острой печеночной недостаточности обнаружены и ангиогенез, и гепатоцитоподобные клетки, а функции печени значительно улучшились [3].
МСК костномозгового происхождения вводили в портальную вену крысам с резецированной печенью [24]. Эта процедура уменьшила фиброз печени. Отмечено более выраженное относительно интактных крыс накопление МСК в печени животных после интоксикации CCl4, также снизилась выраженность фиброза. При остром и хроническом повреждении печени количество альбуминсинтезирующих клеток возросло, увеличился их размер. Адипогенные МСК, введенные крысам после резекции печени после ишемии и реперфузии таким же способом, ингибировали апоптоз гепатоцитов и способствовали регенерации печени.
Исследование функций печени и морфологическое изучение показало одинаковый эффект МСК адипогенного и костномозгового происхождения в условиях острого повреждения печени CCl4 в эксперименте. Такие МСК имеют одинаковые способности к дифференцированию в направлении клеточных элементов печени и одинаковую эффективность при лечении острой печеночной недостаточности [25].
После трансплантации МСК обнаружили в перипортальных и поврежденных областях печени мышей с хроническим повреждением органа, индуцированного введением CCl4. Дифференцирование МСК в гепатоциты подтверждено значительным возрастанием в печени уровня мРНК и экспрессией маркеров печеночных альбуминов и α-фетопротеина. После введения МСК установлены снижение уровня аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) в сыворотке крови и нормализация гистопатологических изменений [26].
В эксперименте на крысах острое повреждение печени моделировали внутрибрюшинной инъекцией D-галактозамина и липополисахарида. Внутривенное применение костномозговых МСК значительно снизило уровни АЛТ и АСТ, уменьшило объем некроза гепатоцитов и выраженность воспалительной инфильтрации. Кроме того, введение МСК ингибировало апоптоз гепатоцитов и улучшило регенерацию печени [27].
МСК костномозгового происхождения снижали выраженность фиброза печени. Помимо паракринного механизма, МСК напрямую через межклеточные контакты в значительной степени ингибируют функции и пролиферацию активированных звездчатых клеток печени [28]. Вместе с тем короткое время выживаемости МСК после внутрипеченочной трансплантации ограничивает их применение. Активированные натуральные киллерные клетки ускоряют удаление трансплантированных МСК. Количество натуральных киллерных клеток и экспрессия маркеров их активации в печени значительно увеличиваются после внутрипеченочного введения МСК — натуральные киллерные клетки активируются именно трансплантацией МСК. Анализ цитотоксичности показал, что активированные натуральные киллеры могут ингибировать пролиферацию МСК и индуцировать их деструкцию [29]. По другим данным[30], спустя 4 ч после внутривенного введения МСК мышам с CCl4-индуцированным воспалительным повреждением печени, большинство МСК задержаны в легких.
И.В. Майбородин и соавт. [31] обнаружили, что после введения взвеси МСК непосредственно в печень крыс в некоторых случаях в органе развивается асептическое воспаление, основной причиной которого является присутствие самих МСК и их детрита. На протяжении 4 нед эксперимента ни в одном случае не произошло дифференцирования введенных МСК в клетки печени.
Следовательно, использование клеточных технологий в терапии заболеваний печени может не только воздействовать на ее репарацию, но и в некоторых случаях сделать ненужными и резекцию, и трансплантацию. Общепринято мнение, согласно которому основной эффект применения МСК при печеночной недостаточности связан с их дифференцированием в клеточные элементы этого органа. Необходимо учитывать и иммуномодуляторное действие МСК при болезнях печени. В то же время появились работы, в которых установлено, что МСК после введения в печень быстро погибают, диссеминируются по другим органам и тканям или вообще элиминируются из организма. В любом случае эффективность клеточной терапии требует дальнейших исследований. Это особенно важно для определения возможных противопоказаний к этому методу лечения и профилактики возможных осложнений.
Заключение
На повреждение печень отвечает гипертрофией оставшейся паренхимы. На регенерацию печени оказывают влияние различные внешние и внутренние факторы. Использование клеточных технологий в терапии заболеваний печени может не только воздействовать на ее репарацию, но и в некоторых случаях сделать ненужными и резекцию, и трансплантацию. Общепринято мнение, согласно которому основной эффект применения МСК при печеночной недостаточности связан с их дифференцированием в клеточные элементы этого органа. Однако появились работы, установившие факт гибели МСК после введения в печень, диссеминацию по другим органам и тканям или элиминацию из организма. После резекции печени следует обращать пристальное внимание не только на восстановление функционально активной паренхимы, но и на регенерацию непаренхиматозных структур — сосудистой сети и желчных протоков. Необходимы дальнейшие исследования для уточнения показаний и противопоказаний к применению МСК, а также для определения профилактических мер с целью исключения возможных осложнений при использовании клеточных технологий.
Работа выполнена при финансовой поддержке ПФНИ ГАН на 2017—2020 гг. (VI.62.2.1, 0309-2016-0006) «Разработка технологий получения материалов для регенеративной медицины и развитие методов восстановления репродуктивного здоровья».
Исследование одобрено локальным этическим комитетом Центра новых медицинских технологий Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.