Введение
По данным базы GLOBOCAN, в 2018 г. рак ободочной кишки занял 4-е место в структуре онкологических заболеваний в мире, составив 11% всех случаев злокачественных новообразований [1]. При этом прогноз выживаемости пациента напрямую зависит от стадии опухолевого процесса на момент диагностики. Так, если пятилетняя общая выживаемость для I стадии колоректального рака (КРР) составляет 92%, то для IV — только 12% [2]. Перитонеальный карциноматоз (ПК) — одна из форм метастазирования КРР по брюшине. Пациентов с ПК длительное время считали инкурабельными, однако с появлением современных химиотерапевтических препаратов медиана выживаемости таких больных может достигать 23 мес [3]. При этом прослеживается прямая корреляция между величиной перитонеального карциноматозного индекса (ПКИ) — показателя, характеризующего распространенность ПК, и выживаемостью. По данным A. Burnett и соавт. (2019), медиана общей выживаемости для пациентов с ПКИ менее 20 баллов достигла 62 мес, с ПКИ более 20 баллов — всего 19 мес [4]. Аналогичные данные получены и при оценке влияния уровня ПКИ на безрецидивную выживаемость: при ПКИ >10 баллов медиана показателя продолжительности жизни исчислялась 10 мес, при ПКИ <3 баллов — 17 мес (p=0,025) [5]. Такой факт указывает на необходимость выявления и лечения ПК на начальной стадии, а также на разработку мер, направленных на предупреждение его развития.
J. Segelman и соавт. (2014), проанализировав результаты лечения 8044 пациентов КРР II—III стадии, показали, что индекс прорастания опухолью кишечной стенки T4 ассоциирован с развитием ПК (ОР 19,44; 95% ДИ 7,72—48,94; p<0,001) [6]. P. Sugarbaker и соавт. (2016) установили, что при глубине инвазии опухоли, соответствующей критерию T4 по 7-й версии классификации TNM, а также при выявлении опухолевых клеток в перитонеальных смывах, у больных раком толстой кишки вероятность развития ПК составляет 40% [7]. Профилактическая интра- или ранняя послеоперационная внутрибрюшная химиотерапия (ВБХТ) с гипертермией может быть вариантом профилактики карциноматоза у таких больных [8]. S. Noura и соавт. (2010) продемонстрировали эффективность проведения ВБХТ у больных КРР II—III стадии с положительными перитонеальными смывами в качестве метода профилактики развития ПК. Согласно результатам исследования проведение ВБХТ позволило снизить риск перитонеальной диссеминации с 50 до 12,5% (p=0,0362) [9]. Следует отметить, что обнаружение свободных опухолевых клеток в брюшной полости в этой работе производили цитологическим методом. Исследовали мазки, приготовленные из центрифугата лаважной жидкости из брюшной полости у больных КРР. Такой метод не позволяет оценить жизнеспособность опухолевых эксфолиантов и определить воздействие ВБХТ на них. В настоящее время наиболее перспективным представляется метод проточной цитофлуометрии с последующим иммунофенотипированием обнаруженных клеток, поскольку он позволяет точно выявить даже небольшие опухолевые жизнеспособные клеточные популяции и определить уровень их экспрессии [10].
Цель исследования — определить влияние ВБХТ митомицином С и гипертермии на уровень экспрессии маркеров интраперитонеальных опухолевых клеток у больных раком ободочной кишки T4.
Материал и методы
С января 2019 по апрель 2020 г. в НМИЦ колопроктологии им. А.Н. Рыжих проведено проспективное двухгрупповое сравнительное исследование, в которое вошли 65 больных раком ободочной кишки, на этапе предоперационного обследования критерий прорастания кишечной стенки был определен как T4. Критериями невключения являлись наличие нерезектабельных метастазов, ПК и неоадъювантная химиотерапия в анамнезе. В основную группу включены 46, в контрольную — 19 пациентов.
У всех пациентов как основной, так и контрольной групп после осуществления операционного доступа брюшную полость орошали 1 л 0,9% водного раствора NaCl. После экспозиции в течение 5 мин перитонеальный смыв аспирировали и подвергали многоступенчатому иммунологическому анализу с применением методики проточной цитофлуометрии для иммунофенотипирования интраперитонеальных опухолевых клеток.
У больных основной группы после выполнения резекции кишки с первичной опухолью проводили ВБХТ с гипертермией закрытым способом. Для этой цели в ушитую брюшную полость через дренажные трубки вводили диализат митомицина С из расчета 20 мг/м2 поверхности тела, подогретый до 42 °C с последующей экспозицией в течение 2 ч. После эвакуации диализата митомицина C из брюшной полости осуществляли ее орошение 1 л 0,9% раствора NaCl. Промывную жидкость использовали для второго иммунологического исследования.
В контрольной группе ВБХТ не проводили, а второй перитонеальный смыв для иммунофенотипирования опухолевых клеток получали тем же способом, что и в основной группе.
Для определения характеристики опухолевых интраперитонеальных клеток использованы следующие поверхностные маркеры: CD133, CD44, CD24, CD26, CD184. Так, CD133 представляет собой гликопротеин, сконцентрированный в выпячиваниях плазматической мембраны, что позволяет предположить, что CD133 может играть роль в образовании межклеточных контактов. Клетки, экспрессирующие CD133, обладают повышенной способностью взаимодействовать с фибробластами опухолевого микроокружения, что указывает на их способность к инвазии и туморогенность по сравнению с клетками, его не экспрессирующими [11].
CD24 — это небольшой гликозил-фосфатидилинозитол (GPI)-связанный мембранный гликопротеин (длиной 27—30 аминокислот) с сайтами гликозилирования, которые связывают P-селектин, что усиливает агрегацию тромбоцитов и способствует миграции опухолевых клеток в сосудистое русло [12, 13].
CD26, также известный как дипептидилпептидаза IV (DPPIV), является гликопротеиновым белком и широко экспрессируется в большинстве типов клеток, включая T-лимфоциты, эндотелиальные и эпителиальные клетки. R. Pang и соавт. (2010) продемонстрировали, что субпопуляция клеток, экспрессирующих CD26, была связана с развитием отдаленных метастазов при КРР путем связывания с компонентами внеклеточного матрикса, такими как фибронектин и коллаген. Отмечено также, что клетки, экспрессирующие CD26, имеют более высокую способность к миграции, инвазии и адгезии к фибронектину и I типу коллагена [14].
Трансмембранный гликопротеин CD44 участвует во многих клеточных процессах, таких как рост, пролиферация, выживание, дифференцировка и подвижность. CD44 активирует и модулирует ряд сигнальных путей, которые играют важную роль в прогрессировании опухоли, метастазировании и резистентности к химиопрепаратам [15, 16].
Анализ групп по полу показал, что в основной группе преобладали мужчины (p=0,0148). Кроме того отмечено, что в основной группе больные были статистически значимо моложе, чем в контрольной — 64 (56,2; 71,8) и 73 (64,5; 80,0) года соответственно (p=0,0039). С учетом статистически значимых различий между группами в отношении пола и возраста данные переменные в дальнейшем использовали в качестве поправочных ковариат в регрессионных моделях. При сравнении групп по размеру, локализации и степени диффференцировки первичной опухоли, ее стадии по классификации TNM, наличию периневральной, венозной и лимфоваскулярной инвазии статистически значимых различий не выявлено (табл. 1).
Таблица 1. Характеристика больных основной и контрольной групп
Table 1. Characteristics of patients in both groups
| Признак | Основная группа (n=46) | Контрольная группа (n=19) | p |
| Мужской пол | 28 (60,9%) | 5 (26,3%) | 0,0148 |
| Возраст, медиана (квартили), лет | 64,0 (56,2; 71,8) | 73,0 (64,5; 80,0) | 0,0039 |
| Размер опухоли, медиана (квартили), см | 6,0 (5,0; 7,0) | 6,0 (5,5; 7,5) | 0,9009 |
| Локализация первичной опухоли: | |||
| правые отделы | 12 (26,1%) | 5 (26,3%) | ≈1,000 |
| левые отделы | 34 (73,9%) | 14 (73,7%) | |
| Grade: | |||
| 2 | 30 (65,2%) | 13 (68,4%) | ≈1,000 |
| 3 | 14 (30,4%) | 6 (31,6%) | |
| 4 | 2 (4,3%) | 0 (0,0%) | |
| T | |||
| 3 | 19 (41,3%) | 10 (52,6%) | |
| 4a | 16 (34,8%) | 4 (21,1%) | |
| 4b | 11 (23,9%) | 5 (26,3%) | |
| N | |||
| 0 | 23 (50,0%) | 8 (42,1%) | 0,4905 |
| 1 (1a,1b,1c) | 10 (21,7%) | 3 (15,8%) | |
| 2 (2a, 2b) | 13 (28,3%) | 8 (42,1%) | |
| M | |||
| 0 | 42 (91,3%) | 17 (89,5%) | ≈1,000 |
| 1 | 4 (8,7%) | 2 (10,5%) | |
| Перифокальное воспаление | 15 (32,6%) | 9 (47,4%) | 0,2755 |
| Венозная инвазия | 18 (39,1%) | 5 (26,3%) | 0,4006 |
| Лимфоваскулярная инвазия | 33 (71,7%) | 13 (68,4%) | 0,7736 |
| Периневральная инвазия | 10 (21,7%) | 5 (26,3%) | 0,7507 |
Статистический анализ и визуализацию полученных данных проводили с использованием программы IBM SPSS. Описательные статистики представлены в виде числа наблюдений (процент наблюдений) для качественных переменных и медианы (1-й и 3-й квартили) для количественных. Для изучения зависимости двух категориальных переменных использовали точный тест Фишера, ассоциацию считали статистически значимой при p<0,05. Для сравнения двух количественных переменных использовали тест Манна—Уитни, различия считали статистически значимыми при p<0,05.
Для анализа динамики уровня изучаемых маркеров использовали смешанные линейные регрессионные модели с включением термина взаимодействия между группой и перитонеальными смывами (двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA с повторными наблюдениями), пол и возраст включали в модели в качестве поправочных ковариат. На основе полученных моделей оценены маргинальные средние значения уровней маркеров (с соответствующими 95% доверительными интервалами) в изучаемых группах для каждого перитонеального смыва с поправкой на пол и возраст. Для анализа различий в уровнях изучаемых маркеров между группами использовали линейные регрессионные модели с включением пола, возраста и исходного уровня соответствующего маркера в качестве поправочных ковариат (ковариационный анализ ANCOVA). На основе полученных моделей оценены маргинальные средние значения уровней маркеров (с соответствующими 95% доверительными интервалами) в изучаемых группах. Различия между группами считали статистически значимыми при p<0,05. Уровни изучаемых маркеров включали в регрессионные модели после log2-трансформации, маргинальные оценки средних значений подвергали обратному преобразованию. Включение в регрессионные модели поправочных ковариат позволило получить оценки коэффициентов и маргинальных средних, не зависящие от наличия исходных различий в значениях данных переменных в сравниваемых группах.
Результаты
При анализе медиан уровней экспрессии маркеров CD133, CD184, CD24, CD26, CD44 в первом перитонеальном смыве обнаружены статистически значимые различия в уровне флуоресценции клеток, экспрессирующих CD184 (p=0,002). В отношении других исследуемых маркеров статистически значимых различий между группами не выявлено (табл. 2).
Таблица 2. Уровень экспрессии маркеров интраперитонеальных опухолевых клеток в первом перитонеальном смыве, ед. фл., медиана (квартили)
Table 2. Expression of intraperitoneal tumor cell markers in the first peritoneal lavage
| Маркер | Основная группа | Контрольная группа | p |
| CD133 | 2,5 (1,9; 12,0) | 3,5 (2,2; 10,2) | 0,4935 |
| CD184 | 2,7 (2,0; 3,1) | 1,9 (1,5; 2,2) | 0,0020 |
| CD24 | 3,0 (2,2; 4,1) | 2,7 (2,0; 3,7) | 0,4028 |
| CD26 | 4,0 (2,8; 6,8) | 5,9 (3,0; 8,3) | 0,2733 |
| CD44 | 3,9 (2,5; 22,6) | 7,2 (2,0; 20,5) | 0,5886 |
Изучение уровня экспрессии маркеров во втором перитонеальном смыве показало наличие статистически значимых различий между основной и контрольной группами в уровне флуоресценции маркеров CD133, CD24, CD26 и CD44 (табл. 3).
Таблица 3. Уровень экспрессии маркеров интраперитонеальных опухолевых клеток во втором перитонеальном смыве, ед. фл., медиана (квартили)
Table 3. Expression of intraperitoneal tumor cell markers in the second peritoneal lavage
| Маркер | Основная группа | Контрольная группа | p |
| CD133 | 2,2 (1,7; 8,3) | 8,3 (2,7; 14,4) | 0,0046 |
| CD184 | 2,0 (1,7; 2,9) | 2,0 (1,7; 2,2) | 0,5653 |
| CD24 | 2,7 (2,1; 4,2) | 4,5 (2,9; 6,5) | 0,0119 |
| CD26 | 2,8 (2,1; 4,2) | 4,8 (3,1; 7,1) | 0,0352 |
| CD44 | 5,3 (2,2; 17,4) | 19,9 (6,8; 25,4) | 0,0156 |
Проведенный выше анализ медиан уровней экспрессии маркеров опухолевых клеток не позволяет сделать заключение об эффективности ВБХТ, поскольку в настоящее время отсутствуют референсные значения указанных маркеров и установлены статистически значимые различия по полу и возрасту в основной и контрольной группах. Данный факт не позволяет при использовании метода Манна—Уитни достоверно утверждать, что полученные значения будут обусловлены именно проведением ВБХТ, а не различиями по полу и возрасту в группах. В связи с этим расчет динамики уровней экспрессии маркеров производили при помощи дисперсионного анализа с включением пола и возраста в модели в качестве поправочных ковариат. Кроме того, в исследуемых группах отмечены различия в исходном уровне экспрессии маркеров. Поэтому для сравнения уровней экспрессии маркеров между группами во втором перитонеальном смыве применен ковариационный анализ с включением пола, возраста и значения экспрессии соответствующего маркера в качестве поправочных ковариат.
Так, установлено снижение уровня экспрессии CD133 с 6,5 (95% ДИ 5,4—7,8) до 5,7 ед. фл. (95% ДИ 4,8—6,8) в основной группе, в то время как в контрольной группе наблюдалось значимое увеличение уровня экспрессии CD133 с 6,7 (95% ДИ 5,0—9,1) до 8,6 ед. фл. (95% ДИ 6,4—11,8). Независимо от исходного значения маркера во втором смыве уровень его экспрессии в основной группе после проведения ВБХТ был в среднем в 1,57 раза ниже по сравнению с контрольной группой, где ВБХТ не проводили (p=0,0168) (рис. 1).
Рис. 1. Гистограмма уровней экспрессии маркера CD133 в динамике.
Fig. 1. Histogram of CD133 marker expression.
Не выявлено статистически значимых различий в уровне экспрессии маркера CD184 в динамике как в основной группе — 4,7 (95% ДИ 4,2—5,2) и 4,4 ед. фл. (95% ДИ 3,9—4,9), так и в контрольной группе — 4,7 (95% ДИ 4,0—5,7) и 4,1 ед. фл. (95% ДИ 3,4—4,9) в первом и во втором смывах соответственно. Однако отмечена тенденция к снижению этого показателя в обеих группах. Независимо от исходного значения маркера во втором перитонеальном смыве уровень его экспрессии в основной группе после проведения ВБХТ был в среднем в 1,2 раза выше по сравнению с контрольной группой (p=0,0605) (рис. 2).
Рис. 2. Гистограмма уровней экспрессии маркера CD184 в динамике.
Fig. 2. Histogram of CD184 marker expression.
В отношении экспрессии CD26 статистически значимых различий между группами не выявлено, однако отмечена тенденция к снижению его уровня экспрессии в обеих группах: с 6,4 (95% ДИ 5,7—7,2) до 5,3 ед. фл. (95% ДИ 4,7—5,9) в основной группе и с 7,1 (95% ДИ 5,9—8,6) до 6,3 ед. фл. (95% ДИ 5,3—7,6) в контрольной группе. Независимо от исходного значения маркера во втором смыве уровень его экспрессии в основной группе после проведения ВБХТ был в среднем в 1,2 раза ниже по сравнению с контрольной группой, однако различия статистически незначимы (p=0,1476) (рис. 3).
Рис. 3. Гистограмма уровней экспрессии маркера CD26 в динамике.
Fig. 3. Histogram of CD26 marker expression.
Выявлено, что в основной группе отмечалось снижение уровня экспрессии CD44 с 8,8 ед. фл. (95% ДИ: 6,7—11,5) в первом смыве до 7,6 ед. фл. (95% ДИ: 5,9—10,0) после проведения ВБХТ. В контрольной группе наблюдалось увеличение его экспрессии с 9,9 (95% ДИ: 6,4—15,4) до 15,9 ед. фл. (95% ДИ: 10,1—25,4). Независимо от исходного уровня маркера во втором смыве его экспрессия в основной группе после проведения ВБХТ была статистически значимо ниже в среднем в 2,5 раза по сравнению с контрольной группой (p=0,0012) (рис. 4).
Рис. 4. Гистограмма уровней экспрессии маркера CD44 в динамике.
Fig. 4. Histogram of CD44 marker expression.
Выявлено, что в основной группе уровень маркера CD24 снизился, составив в первом и втором смывах 5,1 (95% ДИ 4,7—5,6) и 5,0 ед. фл. (95% ДИ 4,7—5,5) соответственно. В контрольной группе наблюдалось увеличение уровня экспрессии маркера CD24 с 4,7 ед. фл. (95% ДИ 4,2—5,4) в первом перитонеальном смыве до 6,3 ед. фл. (95% ДИ 5,4—7,3) во втором смыве. Независимо от исходного значения маркера во втором смыве уровень его экспрессии в основной группе после проведения ВБХТ в среднем был статистически значимо ниже в 1,3 раза по сравнению с контрольной группой (p=0,0455) (рис. 5).
Рис. 5. Гистограмма уровней экспрессии маркера CD24 в динамике.
Fig. 5. Histogram of CD24 marker expression.
Таким образом, в результате сравнительного анализа уровня экспрессии маркеров интраперитонеальных опухолевых клеток с помощью линейных регрессионных моделей выявлены статистически значимые различия между группами во втором смыве в отношении CD133, CD24 и CD44. Уровень CD26 в группах статистически значимо не различался. В отношении маркера CD184 выявлена тенденция к снижению его уровня в обеих группах во втором смыве (p=0,0605), однако статистически значимых различий не получено.
Обсуждение
Анализ экспрессии маркеров интраперитонеальных опухолевых клеток показал, что в основной группе после проведения ВБХТ с гипертермией во втором перитонеальном смыве отмечается статистически значимое снижение уровней экспрессии CD133, CD24, CD44, в то время как в контрольной группе наблюдается увеличение экспрессии CD133.
Из анализа литературы следует, что CD133 наиболее изученный и часто используемый маркер для выявления опухолевых клеток [17—19]. Этот факт объясняется тем, что с экспрессией CD133 при КРР связана реализация нескольких сигнальных путей (Wnt, трансформирующий фактор роста бета, Hedgehog и др.), обеспечивающих рост и поддержание функции раковых стволовых клеток [20]. Таким образом, полученное статистически достоверное снижение экспрессии CD133 у больных основной группы во втором смыве позволяет сделать вывод, что проведение ВБХТ с гипертермией снижает содержание интраперитонеальных опухолевых клеток в брюшной полости по сравнению с группой контроля, что потенциально может минимизировать риск развития перитонеальной диссеминации у таких больных.
Уменьшение же уровня экспрессии CD44 у больных основной группы, зарегистрированное в исследовании, согласно данным Y. Yan и соавт. (2015), свидетельствует о снижении функциональной активности интраперитонеальных опухолевых клеток, в частности о способности опухоли к росту, миграции ее клеток, активации эпителиально-мезенхимального перехода и устойчивости к химиотерапии [21].
Связывание CD24 с одним из его лигандов — P-селектином, известным как рецептор адгезии на тромбоцитах и эндотелиальных клетках, обеспечивает миграцию опухолевых клеток в кровоток и является важным этапом в развитии отдаленных метастазов [12]. Согласно полученным в исследовании данным, в основной группе отмечено снижение экспрессии CD24 во втором перитонеальном смыве, что позволяет предположить уменьшение способности клеток к формированию метастазов после проведения ВБХТ. Таким образом, в проведенном исследовании показано угнетение интраперитонеальных опухолевых клеток рака ободочной кишки при воздействии ВБХТ, заключающееся в снижении экспрессии CD133, CD44, CD24. Тем самым ВБХТ позволяет подавить функциональную активность опухолевых клеток и воздействовать на разные этапы метастатического каскада, выступая в качестве возможной меры профилактики развития ПК, местного рецидива и отдаленных метастазов.
В ряде исследований также продемонстрировано, что экспрессия указанных маркеров у больных КРР — негативный прогностический фактор выживаемости. Так, K. Seo и соавт. (2015) при мультивариантном анализе выявили, что экспрессия CD24 является негативным прогностическим фактором безрецидивной выживаемости у пациентов с КРР (ОР 3,768; 95% ДИ 1,077—13,185; p=0,038) [22]. Метаанализ, включивший 48 исследований, продемонстрировал связь между экспрессией CD44 и снижением общей выживаемости (ОР 1,32; 95% ДИ 1,08—1,61; p=0,007) [23]. Авторы, проанализировав 15 исследований, выявили, что экспрессия клетками CD133 является независимым прогностическим фактором, коррелирующим с общей (ОР 0,67, 95% ДИ 0,54—0,82; p<0,01) и безрецидивной выживаемостью (ОР 0,71, 95% ДИ 0,52—0,96; p=0,03) [24]. Однако этот факт требует дальнейшего изучения.
Таким образом, полученные в исследовании результаты позволяют сделать вывод, что проведение ВБХТ с гипертермией у больных с инвазией опухолью ободочной кишки всей кишечной стенки позволяет уменьшить экспрессию, туморогенность и пролиферативный потенциал свободных опухолевых клеток. Для определения прогностической ценности ВБХТ у больных раком ободочной кишки как стратегии профилактики развития ПК и местного рецидива рака, а также для анализа ее влияния на показатели выживаемости, необходимо продолжение исследования с оценкой отдаленных результатов.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Шелыгин Ю.А., Ачкасов С.И, Сушков О.И.
Сбор и обработка материала — Сухина М.А., Сайфутдинова К.Р.
Статистическая обработка — Сайфутдинова К.Р., Муратов И.И.
Написание текста — Сайфутдинова К.Р., Сушков О.И.
Редактирование — Шелыгин Ю.А., Ачкасов С.И., Шахматов Д.Г.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.