Известно, что биоэнергетика сердца при хронической сердечной недостаточности (ХСН) претерпевает значительные изменения — происходит постепенный переход от потребления жирных кислот к аэробному гликолизу. При гипертрофии левого желудочка (ЛЖ) наблюдается увеличение активности гликолитических ферментов и окисления глюкозы. Переключение на метаболизм углеводов при развитии тяжелой стадии ХСН совпадает с увеличением конечно-диастолического давления в ЛЖ и декомпенсацией ХСН [1]. Но при дальнейшем ремоделировании ЛЖ аэробный гликолиз ослабляется и происходит накопление лактата [2]. В эксперименте и в клинических исследованиях отмечены снижение активности комплексов дыхательной цепи и ферментов цикла трикарбоновых кислот, уменьшение экспрессии целого ряда митохондриальных белков, что ограничивает генерацию аденозинтрифосфата (АТФ), функцию креатинкиназных систем в митохондриях и цитозоле и в целом работу сердца при нагрузках [3, 4]. Показаны связи между клеточными показателями биоэнергетики (содержанием макроэргических фосфатов, отношением фосфокреатин (ФКр)/АТФ в сердце) и классами ХСН по NYHA или индексами систолической и диастолической функции. Считается, что низкое отношение ФКр/АТФ может быть предиктором смертности от сердечно-сосудистых заболеваний [5].
В Институте экспериментальной кардиологии ФГБУ «НМИЦ кардиологии» МЗ РФ в течение ряда лет изучают модель ХСН, вызванную доксорубицином (ДОКС). Показано, что после 4 еженедельных инъекций ДОКС примерно у ¾ крыс возникает диастолическая, а у 1/3 — систолическая дисфункция [6]. Задача данной работы состояла в определении содержания метаболитов энергетического обмена in vivo у крыс с одновременной характеристикой сократительной функции сердца при неинвазивном и инвазивном исследовании. Ранее было показано, что содержание адениннуклеотидов и ФКр снижено после 4-недельного введения ДОКС, но эти измерения были сделаны в конце опыта на изолированном сердце, после выполнения нагрузoк частотой [7]. Остался неясным вопрос, каково содержание метаболитов энергетического метаболизма в сердце in situ еще до применения инвазивного воздействия. Эти результаты сопоставлены в данной статье с функциональным состоянием сердца.
Материал и методы
В работе использованы крысы-самцы Wistar весом 250—300 г. Животные были разделены на две группы, одна группа крыс получала подкожно ДОКС (адриабластин, Pfizer, Германия) в дозе 2 мг/кг еженедельно в течение 4 нед, а другая — физиологический раствор. В острый опыт крыс брали через 8 нед. Перед началом введения ДОКС и через 8 нед всем крысам проведена эхокардиография (ЭхоКГ), после этого выполнены инвазивные исследования.
Трансторакальная ЭхоКГ выполнена на аппарате фирмы FUJIFILM Visual Sonic модель Vevo 1100 (Нидерланды) с линейным датчиком 13—24 МГц и максимальной глубиной лоцирования 30 мм. У крыс под наркозом (Золетил 100, Virbac Sante Animale, Франция, 5 мг/кг) выбривали переднюю стенку грудной клетки, использовали парастернальный доступ по короткой и длинной осям. В B-режиме измеряли диастолические и систолические размеры ЛЖ, на их основе рассчитывали объем ЛЖ в диастоле и систоле, толщину стенок, а также фракцию выброса (ФВ). Полученные изображения сохраняли на приборе Vevo 1100 для дальнейшего анализа и затем их архивировали на внешних носителях.
Инвазивное исследование сократительной функции сердца выполняли у наркотизированных (Золетил 100,5 мг/кг) крыс при помощи стандартного PV-катетера FTH-1912B-8018, усилителя ADV500 («Transonic», Канада), а также АЦП PowerLab 4/35 с программой LabChart 8.1 («ADInstruments», Австралия). ЛЖ катетеризировали через правую сонную артерию PV-катетером, а яремную вену — полиэтиленовым катетером PE-60. Регистрацию параметров гемодинамики и сократительной функции начинали после поиска оптимального места расположения измерительного катетера в ЛЖ путем перемещения вдоль длинной оси желудочка.
В конце опыта у наркотизированных животных проводили торакотомию и далее быстро замораживали сердца щипцами Волленбергера, охлажденными в жидком азоте. Для изучения метаболического состояния сердца замороженную ткань гомогенизировали в холодной 6% HClO4 (10 мл/г ткани) в гомогенизаторе Ultra-Turrax T-25 («IKA-Labortechnik», Германия). Белки осаждали центрифугированием (центрифуга Sorvall RT1, «Thermo Fisher Scientific», США) при 2800×g в течение 10 мин при 4 °C. Супернатанты нейтрализовали 5 М К2СО3 до рН 7,4. Осадок KСlO4 отделяли центрифугированием в тех же условиях. Безбелковые экстракты хранили при –20 °С до определения метаболитов. Сухой вес гомогенизированной ткани определяли после высушивания образцов в течение суток при 110 °C. АТФ и ФКр в тканевых экстрактах определяли спектрофотометрически, используя глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, гексокиназу и креатинкиназу [8]. Содержание АДФ и аденозинмонофосфата в тканевых экстрактах определяли с помощью миокиназы, пируваткиназы и лактатдегидрогеназы [9]. Для определения креатина (Кр) использовали сопряженные реакции с креатинкиназой, пируваткиназой и лактатдегидрогеназой [10]. Лактат определяли с помощью лактатдегидрогеназы [11]. Содержание метаболитов выражали в мкмоль/г сухого веса.
Статистическая обработка результатов выполнена с применением t-теста Стьюдента.
Результаты
Исходные ЭхоКГ-показатели соответствовали ранее полученным данным (табл. 1)
Результаты изучения содержания макроэргических фосфатов в миокарде крыс показали, что в группе ДОКС как общее содержание фонда адениннуклеотидов (ΣАН), так и содержание индивидуальных адениннуклеотидов не отличалось достоверно от этих показателей в контрольной группе (табл. 2).
Результаты опытов по катетеризации, выполненной в конце исследования, показывают, что конечно-диастолический объем ЛЖ у животных группы ДОКС достоверно не изменился по сравнению с контрольной группой, но давление в конце диастолы было значительно повышено, а ФВ снижена на 28% (табл. 3).
Обсуждение
В данной работе применение ДОКС прекращали через 4 нед, а исследование сердца выполняли через 8 нед с начала его введения. Оказалось, что все сердца, в которых оценивали содержание энергетических метаболитов, характеризовались систолической дисфункцией, наблюдаемой ранее при 8-недельном введении препарата [6]. Это означает, что ДОКС оказывает отставленный эффект, реализующийся через перекисное окисление липидов и нарушение синтеза ДНК и РНК в кардиомиоцитах [12, 13].
В сердце система ФКр—Кр выполняет роль не только депо энергии, но и переносчика энергии [14]. Известно, что в митохондриях сердца максимальная скорость синтеза ФКр соответствует максимальной активности окислительного фосфорилирования [15]. В связи с этим передача энергии в сердечной мышце зависит от того, насколько эффективно осуществляет свою функцию митохондриальная креатинкиназа. Измерение метаболитов энергетического обмена в миокарде, выполненное в настоящей работе, показало, что применение ДОКС не повлияло на содержание АТФ и общего фонда адениннуклеотидов (ΣАН), но существенно снизило отношение ФКр/АТФ, являющееся одним из важнейших показателей энергетического обеспечения миокарда [5, 6]. Считается, что низкое отношение ФКр/АТФ может быть предиктором смертности от сердечно-сосудистых заболеваний [5].
В наших опытах соотношение ФКр/АТФ, как и содержание ΣКр в миокарде, было снижено за счет ФКр. При наличии практически нормального уровня Кр это может указывать на снижение активности митохондриальной креатинкиназы, катализирующей перенос фосфатного остатка с АТФ на Кр с образованием ФКр. В этих условиях нормальный уровень АТФ может поддерживаться за счет усиления анаэробного гликолиза, о чем свидетельствует семикратное увеличение содержание лактата в миокарде (табл. 2). Переключение на метаболизм углеводов при развитии ХСН совпадает с увеличением конечно-диастолического давления в ЛЖ, увеличением активности гликолитических ферментов с постепенным ослаблением аэробного гликолиза и накоплением лактата [1].
Фракция выброса, измеренная при ЭхоКГ и при катетеризации, оказалась довольно близкой как у контрольных животных, так и у крыс, получавших ДОКС. Но при катетеризации величина конечно-диастолического объема в контрольных опытах была значительно увеличена — с 0,29 до 0,48 мл. Два фактора послужили вероятной причиной такого увеличения — наличие катетера в ЛЖ, а также замедление частоты сокращений на 21% с соответствующим увеличением времени наполнения ЛЖ.
Заключение
Таким образом, для систолической дисфункции характерно преимущественное нарушение образования ФКр из АТФ. В свою очередь, недостаточный транспорт ФКр в миофибриллы может повышать их упругость, проявляющуюся в повышении диастолического давления и составляющую основу снижения силы сокращения.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ № 18−015−00271 и № 18−015−00008.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Сведения об авторах
Студнева Ирина Михайловна — к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории метаболизма сердца Института экспериментальной кардиологии; тел.: +7(495)414-6737; e-mail: imstudneva@gmail.com
Веселова Оксана Михайловна — к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории метаболизма сердца Института экспериментальной кардиологии; тел.: +7(495)414-6737; e-mail: oxanamma@mail.ru
Просвирнин Антон Викторович — врач функциональной диагностики отдела ультразвуковых методов исследования Института клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова; e-mail: fo_ton@mail.ru
Абрамов Александр Александрович — научный сотрудник лаборатории экспериментальной патологии сердца Института экспериментальной кардиологии; тел.: +7(495)414-6755; e-mail: ferk_88@list.ru
Лакомкин Владимир Леонидович — к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории экспериментальной патологии сердца Института экспериментальной кардиологии; тел.: +7(495)414-6755; e-mail: v.lakomkin@yandex.ru
Капелько Валерий Игнатьевич — д.м.н., проф., главный научный сотрудник лаборатории экспериментальной патологии сердца Института экспериментальной кардиологии; тел.: +7(495)414-6754; e-mail: valk69@yandex.ru