Применение клеточных технологий требует все большего внимания из-за определенных, до конца не исследованных особенностей их действия. Мультипотентные стромальные клетки (МСК) являются мощными иммуномодуляторами, но все же их биологическая деятельность может быть не строго детерминированной, а определяться микроокружением. Наряду с противовоспалительным действием МСК есть данные, что они могут давать прямой антифиброзный эффект [1].

Культуральная среда после выращивания МСК жировой ткани подавляет фибротические процессы в глубоких слоях кожи, уменьшаются объем коллагена и формирование рубцовой ткани [2]. МСК пуповинной крови человека снижают выраженность развития соединительной ткани и портальной гипертензии при индуцированном фиброзе печени у мышей и крыс [3, 4]. МСК жировой ткани человека значительно уменьшили выраженность повреждений почечной ткани после введения цисплатина крысам с появлением признаков начала регенерации уже на 4-й день и ограничением фиброзирования 30 сут [5]. МСК продемонстрировали эффективность при ряде фиброзных заболеваний легких [6]. Антифибротическое действие МСК, полученных из различных источников, подтверждено в экспериментах по изучению ингибиции этими клеточными элементами лизиса эндотелиоцитов сосудов трансплантированного органа Т-лимфоцитами [7]. Необходимо отметить, что в литературе [8, 9] есть единичные косвенные данные о возможности дифференцировки МСК в фибробласты и фиброза в результате использования клеточных технологий.

Вместе с этим научные исследования показали целесообразность применения МСК в хирургии для ускорения формирования грануляций, а значит и более эффективного очищения области операции от детрита [10]. Но любое хирургическое вмешательство сопровождается пересечением сосудов разного диаметра, многие из этих сосудов, в том числе и вены, лигируются [11], в остальных образуются тромбы [10]. Остается невыясненным, как отреагирует организм пациента или экспериментального животного на использование МСК, например для ускорения формирования грануляций и быстрого заживления [10, 11] на фоне присутствия шовного материала [12], а также множества перевязанных [11] и тромбированных [10] сосудов.

В связи с визуально заметными различиями формирования рубца после применения аутологичных мезенхимальных МСК костномозгового происхождения (АММСККП) для коррекции острого локального нарушения венозного оттока в эксперименте была поставлена цель — изучить особенности склеротической трансформации тканей крыс после введения АММСККП на фоне лигирования магистральной вены.

В качестве модели были использованы самцы крыс линии Wag массой 180—200 г, возраст 6 мес. Все манипуляции с животными осуществляли под общим ингаляционным эфирным наркозом в условиях чистой операционной с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных».

АММСККП получали, культивировали, трансфицировали ДНК плазмиды, содержащей ген зеленого флюоресцентного белка GFP, и окрашивали раствором Vybrant CM-Dil в соответствии с проведенными нами ранее работами [10, 11].

Для лигирования осуществляли хирургический доступ к бедренной вене, перевязывали ее поливолоконным плетеным шовным материалом Викрил 3/0 (который сохранялся в месте применения вплоть до окончания эксперимента) как можно ближе к месту впадения в глубокую вену, огибающую подвздошную кость, и ушивали кожную рану. Через сутки без удаления лигатуры после дезинфекции кожи спиртом подкожно инсулиновым шприцем вводили 100 мкл суспензии АММСККП в культуральной среде (10⁶ клеток в 1 мл) в область лигированной вены: иглу вводили подкожно, примерно на 1 см дистальнее разреза, продвигали в проксимальном направлении до лигатуры (которая хорошо пальпировалась через кожу даже после операции), наложенной на вену. В качестве контроля использовали три группы животных: интактных крыс; животных с перевязанной веной без введения АММСККП; ложнооперированных (разрез кожи без лигирования вены с последующей инъекцией АММСККП). В каждой группе на каждом этапе эксперимента было по 10—12 животных. Животных опытной и контрольных групп выводили из эксперимента через 4 сут, 1, 2, 3, 4 и 5 нед после инъекции АММСККП.

Бедренную вену, взятую вместе с окружающими тканями, вплоть до мышечной (что обеспечивало полное попадание паравазальной клетчатки в препарат), и с лигатурой, на протяжении не менее 5 мм в проксимальном и дистальном направлениях от места впадения бедренной вены в глубокую вену, фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) не менее 24 ч, обезвоживали в градиенте этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в гистопласт. Срезы толщиной 5—7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, изучали на световом микроскопе Axioimager M1 («Zeiss», Германия) при увеличении до 1200 раз, также неокрашенные срезы исследовали в режиме люминесценции указанного микроскопа с фильтрами Alexa 488 или для родамина.

Во всех типах соединительной ткани межклеточное вещество преобладает над клетками по объему, т. е. межклеточное вещество очень хорошо выражено. Принципиальные различия типов соединительной ткани определяются соотношениями клеточных компонентов и характером межклеточного вещества. В норме в паравазальной клетчатке преобладает рыхлая волокнистая соединительная ткань с хорошо развитым межклеточным веществом, где преобладает аморфный компонент, который является гидрофильным и имеет студнеобразную консистенцию, коллагеновые и эластические волокна являются тонкими, располагаются рыхло и идут в разных направлениях. При склеротической трансформации вокруг сосудов развивается плотная волокнистая соединительная ткань, характеризующаяся тем, что коллагеновые волокна объединены в толстые пучки, плотно прилегающие друг к другу (что и делает ткань плотной) и ориентированные в одном (плотная оформленная волокнистая соединительная ткань) или в различных направлениях (не оформленная ткань).

Для исследования относительной площади плотной оформленной и не оформленной волокнистой соединительной ткани на срезе паравазальной клетчатки (в процентах от площади среза клетчатки) проводили измерения изображений, полученных при помощи цифровой видеокамеры микроскопа, на экране компьютера с использованием программного обеспечения морфологического модуля Axiovision («Zeiss», Германия). Для каждого животного проводили от 3 до 5 измерений различных случайных срезов, полученных с объектов, ориентированных для получения максимальной площади. При использовании объектива с увеличением 5 конечная площадь тестового прямоугольника была равна 5 600 000 мкм² (стороны 2800×2000 мкм), при объективе с увеличением 10 она равнялась 1 400 000 мкм² (стороны 1400×1000 мкм), при объективе с увеличением 20 площадь составляла 350 000 мкм² (стороны 700×500 мкм).

Статистическую обработку результатов проводили на прикладной статистической программе MS Excel 7.0 («Microsoft», США), определяли среднее арифметическое и стандартное отклонение. Достоверность различий сравниваемых средних величин определяли на основании критерия Стьюдента. Достоверным считали различие между сравниваемыми рядами с уровнем доверительной вероятности 95% и выше. На основании использования в эксперименте линейных, генетически идентичных животных, реагирующих на воздействие однонаправленно и практически с одинаковой выраженностью, при расчетах учитывали, что распределение исследуемых признаков было близким к нормальному.

У интактных крыс клетчатка в области сосудисто-нервного пучка бедра представлена в основном жировой и рыхлой волокнистой соединительной тканью (рис. 1, а), площадь плотной волокнистой соединительной ткани на срезе составляет 32,5±3,23% от площади всех тканей и структур (см. таблицу).

Спустя 4 сут после операции объем плотной волокнистой соединительной ткани несколько (статистически недостоверно) снизился во всех группах животных (см. рис. 1, б; см. таблицу).

Через 1 нед у всех крыс сосудисто-нервный пучок был заключен в широкий массив плотной волокнистой соединительной ткани (см. рис. 1, в, г), но в среднем по группам ее площадь на срезе достоверно не отличалась от таковой у интактных животных (см. таблицу). На некоторых участках еще сохранились типичные грануляции (см. рис. 1, в, г).

Ко 2-й неделе после операции площадь плотной волокнистой соединительной ткани у животных после лигирования вены без введения АММСККП, после инъекции АММСККП на фоне неизмененного оттока крови и после применения клеточной терапии на фоне перевязанной вены статистически достоверно выросла по сравнению с интактными крысами (см. рис. 1, д; см. таблицу). Иногда в плотной волокнистой соединительной ткани и в ее прослойках в жировой клетчатке было расположено множество мелких сосудов, похожих на грануляции: такие структуры чаще были найдены после использования АММСККП для коррекции нарушенного венозного оттока.

На следующий срок 3 нед было найдено дальнейшее прогрессирование склеротической трансформации тканей в области сосудисто-нервного пучка бедра животных после операции (см. рис. 1, е). Площадь плотной волокнистой соединительной ткани в области магистральных сосудов бедра после перевязывания вены без использования клеточных технологий, после введения АММСККП без нарушения венозного кровотока и после применения АММСККП в условиях наложения лигатуры на вену была также статистически значимо больше по сравнению с интактными крысами (см. таблицу). Особенностью рубца в области магистральных сосудов бедра крыс после введения АММСККП являлось присутствие единичных фибробластоподобных клеточных элементов с интенсивной флюоресценцией мелких цитоплазменных включений при использовании родаминового фильтра (см. рис. 1, ж, з).

К 4-й неделе эксперимента площадь плотной волокнистой соединительной ткани после перевязывания вены без использования клеточных технологий, после введения АММСККП без нарушения венозного кровотока и после применения АММСККП в условиях наложения лигатуры на вену по-прежнему была достоверно выше по сравнению с интактными крысами (рис. 2, а, б). Примечательно, что размер рубца у крыс после инъекции АММСККП на фоне неизмененного оттока крови был статистически значимо больше, чем у животных после только перевязывания вены, несмотря на присутствие в тканях крыс последней группы нелизированного инородного тела — лигатуры. Величина значения этого показателя после лигирования вены и инъекции АММСККП стала выше относительно крыс с перевязанной веной без использования клеточных технологий (см. рис. 2, а, б; см. таблицу). У животных после введения АММСККП в послеоперационном рубце также были обнаружены клетки, похожие на фибробласты, люминесцирующие в условиях применения фильтра для родамина.

Через 5 нед вокруг магистральных сосудов площадь плотной волокнистой соединительной ткани после только лигирования вены, после инъекции АММСККП на фоне неизмененного оттока крови и после применения клеточных технологий с предварительным перевязыванием вены оставалась статистически значимо больше по сравнению с интактными крысами (см. рис. 2, в, г). Но в группе животных после введения АММСККП без лигирования вены объем рубца значительно уменьшился относительно прошлого срока. У крыс с перевязанной веной и последующим использованием АММСККП величина значения данного показателя была выше, чем в группах с блокадой вены без применения клеточных технологий и после инъекции АММСККП на фоне сохраненного оттока крови (см. рис. 2, в, г; см. таблицу). На этот срок по-прежнему в группах крыс после инъекции АММСККП в структурах плотной волокнистой соединительной ткани были найдены цепочки и группы отдельно расположенных вытянутых клеточных элементов, похожих на фибробласты. В таких клетках было отмечено очень яркое свечение части цитоплазмы или разнокалиберных включений при использовании родаминового фильтра (см. рис. 2, д, е).

Следует отметить, что на этапах эксперимента не произошло заметного уменьшения объема шовного материала, используемого для лигирования вены, хотя к концу наблюдения его нити были окружены макрофагами и гигантскими клетками инородных тел (см. рис. 2, б, ж, з). В рубцовой ткани, развившейся возле нитей, обнаружены обширные геморрагии, многочисленные мелкие сосуды, скорее всего, грануляции, и лейкоцитарная инфильтрация с преобладанием макрофагов и лимфоцитов, также присутствовали слившиеся многоядерные макрофаги. Явления склероза и макрофагальная инфильтрация с формированием гигантских клеток инородных тел были найдены и в тканях, непосредственно прилегающих к лигатуре (см. рис. 2, з).

Относительная площадь плотной волокнистой соединительной ткани на срезе клетчатки в области магистральных сосудов всех групп животных после операции сначала недостоверно снизилась, что связано с отеком и увеличением процента сосудистого компонента как реакцией на повреждение: разрез кожи с или без перевязывания бедренной вены.

Начиная со 2-й недели объем плотной волокнистой соединительной ткани становится больше, чем в интактном контроле, и остается повышенным все остальное время наблюдения. Наиболее вероятно, что такая склеротическая трансформация паравазальной клетчатки обусловлена непосредственно рассечением тканей, лигированием магистральной вены и ушиванием кожи. Постепенно некротизированные и лизируемые структуры замещаются соединительной тканью.

Тенденция к уменьшению объема плотной волокнистой соединительной ткани в области хирургического вмешательства была найдена при лигировании вены без применения клеточных технологий к 4-й неделе, а после введения АММСККП в условиях сохраненного венозного кровотока — к 5-й неделе. Не исключено, что идет постепенная реорганизация послеоперационного рубца в рыхлую соединительную и жировую ткани, которые обычно расположены в области сосудисто-нервного пучка, а также возможно уплотнение существующего рубца с постепенным развитием новой жировой клетчатки вокруг магистральных сосудов.

При моделировании острой локальной венозной блокады лигирование сосуда осуществляли толстым медленно деградирующим шовным материалом. Абсорбирование такого материала сопровождается его инкапсуляцией плотной волокнистой соединительной тканью и гранулематозным воспалительным процессом [12]. Фактически все время наблюдения этот материал вел себя как инородное тело в тканях рядом с магистральной веной, обусловливая больший уровень склероза в прилежащих тканях [10, 12]. Следовало бы ожидать более значительный объем рубца в группах у крыс с перевязанной веной (тем более, что свой вклад в процессы склероза вносят постепенные атрофия, облитерация и склеротическая трансформация лигированного сосуда) относительно ложнооперированных животных, но с использованием АММСККП. Однако через 4 нед при лигировании вены без применения АММСККП явления склероза статистически достоверно менее выражены, чем после применения клеточных технологий без нарушения венозного оттока.

По-видимому, существует вероятность развития соединительной ткани как результат введения АММСККП; можно предположить индукцию развития рубца именно использованием АММСККП. Существует вероятность как дифференцировки АММСККП в клетки соединительной ткани — фибробласты, так и стимуляции пролиферации и формирования коллагена собственными фибробластами. Последнее возможно в результате синтеза каких-то цитокинов или влияния веществ, попадающих в ткани при разрушении инъецированных АММСККП [11]. Следует отметить присутствие в литературе только косвенных данных о возможности дифференцировки АММСККП в фибробласты, усилении процессов склероза и фиброза [8, 9]. Наоборот, большинство исследователей сообщают о подавлении фибротических процессов в результате применения клеточных технологий [1—7]. Но вместе с этим некоторые даже из этих работ содержат сведения о возможной профиброзной роли эндогенных МСК в ответ на повреждение [1].

Можно предположить, что после инъекции АММСККП они распространяются в тканях и начинают формировать сосуды [10, 11], которые, прорастая через ткани, повреждают их. К таким местам и участкам тканей, где содержится много детрита АММСККП, так как не все они жизнеспособны и часть их погибает после введения в ткани [11], мигрируют лейкоциты, и начинается асептический воспалительный процесс. Воспаление также необходимо для репарации поврежденных при разрезе и ушивании раны тканей.

Постепенно ткани с большим содержанием детрита АММСККП, а также с активным воспалительным процессом, инициированным той или иной причиной, замещаются соединительной тканью, сначала рыхлой, затем плотной волокнистой. Инволюция сосудов, непосредственно развившихся из дифференцирующихся АММСККП или при паракринном влиянии этих клеточных элементов [13—15], также сопровождается развитием соединительной ткани, точно также, как и в процессе инволюции грануляций.

Начиная с 3-й недели в структурах плотной соединительной ткани рубца присутствовали единичные клеточные элементы со свечением мелких цитоплазменных включений при использовании родаминового фильтра. Эти клетки были крупными, имели вытянутую форму и были похожи на фибробласты. Можно предположить, что после инъекции АММСККП, меченных белком GFP и мембранным красителем, часть их дифференцируется в фибробласты [8, 9] и другие клетки фибробластного ряда и участвует в формировании плотной волокнистой соединительной ткани в месте хирургического разреза. Также не исключено, что введенные АММСККП дифференцируются в клетки оболочек сосудов грануляций [10], а по мере инволюции их некоторые структуры оказываются в фибробластах, синтезирующих коллаген в процессе образования рубца. В результате этого клеточные элементы соединительной ткани приобретают способность к люминесценции как при использовании фильтра Alexa 488 (белок GFP или его ДНК), так и на фоне применения фильтра для родамина (Vybrant-CM-Dil) [11].

Обнаружение таких окрашенных структур только после 3 нед наблюдения можно объяснить тем, что на более ранние временны́е точки светящиеся фибробластоподобные клеточные элементы были маскированы большим числом ярко флюоресцирующих других клеток: недифференцированных АММСККП, макрофагов и клеток сосудистых оболочек [11]. К 3-й неделе число клеточных элементов со свечением вследствие миграции или деструкции значительно уменьшилось, и стали более заметны флюоресцирующие вытянутые тонкие клеточные элементы соединительной ткани, похожие на фибробласты.

Можно предположить, что возможность дифференцировки АММСККП в клеточные элементы соединительной ткани служит главной причиной появления обширных разрастаний соединительной ткани вокруг магистральных сосудов после применения клеточных технологий для восстановления кровотока в условиях лигированной вены [11].

Таким образом, хирургическая операция, локальная блокада вены с внедрением в ткани инородного тела (лигатура) запускают воспалительный процесс с формированием соединительной ткани. Введение АММСККП на таком фоне приводит или к дифференцировке их в фибробласты (несмотря на многочисленные данные литературы [1—7] об антифибротическом эффекте применения клеточных технологий), или к ускорению и усилению склероза. Возможна стимуляция миграции лейкоцитов к месту инъекции АММСККП как к чужеродным объектам (ДНК белка GFP и сам этот протеин — вирусный вектор внедрения данной ДНК в геном клеток). В последнем случае возможно как усиление воспалительной реакции в области сосудов и рассасывающейся лигатуры с потенцированием склеротического процесса, так и дополнительное формирование соединительной ткани в качестве ответной реакции на введение АММСККП: для их отграничения, изоляции от организма.

Таким образом, инъекция АММСККП после хирургического вмешательства, связанного с перевязыванием магистральной вены, приводит к формированию более обширного рубца, что связано с вероятностью как дифференцировки АММСККП в клетки соединительной ткани — фибробласты, так и стимуляции пролиферации и синтеза коллагена собственными фибробластами, хотя такое предположение противоречит основным данным литературы. Хирургическая операция сама по себе сопровождается склеротической трансформацией тканей, обусловленной прямым повреждением и хроническим воспалением, вызванным присутствием в течение длительного времени медленно деградируемой лигатуры. Введение АММСККП на таком фоне, по-видимому, потенцирует явления склероза. В отдаленные сроки не исключено уменьшение объема плотной волокнистой соединительной ткани из-за реорганизации рубца.

Работа выполнена при финансовой поддержке программ ПФНИ ГАН на 2017—2020 гг. (VI.62.2.1, 0309−2016−0006) «Разработка технологий получения материалов для регенеративной медицины и развитие методов восстановления репродуктивного здоровья» и ПФИ РАН по приоритетному направлению I.30П (ФИМТ-254, 0309−2015−0017) «Разработка новых клеточных технологий коррекции венозных тромботических процессов, основанных на введении мезенхимальных стромальных клеток в участок формирования тромба».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — И.М., А.Ш., В.М.

Сбор и обработка материала — И.М., А.Ш., В.М., А.А., Н.Ф., Р.М., С.Х.

Статистическая обработка — И.М.

Написание текста — И.М., А.Ш., В.М.

Редактирование — И.М., А.Ш., В.М.