Введение

Трофические язвы относятся к высшему клиническому классу венозных заболеваний по классификации CEAP-C6 и встречаются у 1—2% трудоспособного населения [1]. Трофические язвы, ассоциированные с патологией венозного кровообращения, считаются хроническими ранами со всеми атрибутами сложной перестройки экстрацеллюлярного матрикса и ремоделированием тканей краев и дна этих ран. В отсутствие возможности устранения этиологического фактора образования язвы основным способом лечения остается местное медикаментозное воздействие [2].

В настоящее время предложен принципиально новый способ оптимизации процесса заживления ран на основе разработанного метода клеточно-заместительной терапии [3, 4]. Дерма кожи содержит рыхлую волокнистую соединительную ткань, в которой основным белковым компонентом является коллаген I типа, а основным клеточным пулом — фибробласты, отвечающие главным образом за его биосинтез и ремоделирование [5]. Создание на основе этих основных компонентов искусственной конструкции — дермального эквивалента — стало важным шагом в лечении незаживающих ишемизированных ран, закрывающих дефект кожи и создающих оптимальные условия для пролиферации и функционирования основных клеточных элементов в процесс регенерации кожи [6].

Ряд авторов предлагают новые доступные подходы для поддержки регенеративного процесса при заживлении длительно незаживающих ишемизированных кожных дефектов. Так, полидезоксирибонуклеотиды, полученные из спермы форели методом экстракции, широко используются для лечения ран посредством местного и системного применения благодаря их способности стимулировать клеточную миграцию и рост, ангиогенез и уменьшение воспаления в поврежденной коже [7].

Однако данные об ультраструктурных особенностях биоптатов заживающих ишемизированных кожных дефектов при трансплантации дермального эквивалента с дермальными фибробластами и при поддержке полидезоксирибонуклеотидами единичны и редки, что делает настоящее исследование актуальным.

Цель исследования: оценка эффективности метода аллопластики ишемизированного кожного дефекта на основе изучения морфологии биоптатов и ультраструктурной характеристики регенерационного гистиона дермы биоптатов на 23-и сутки заживления ишемизированного дефекта у мышей после трансплантации дермального эквивалента с культивированными аллофибробластами и при поддержке полидезоксирибонуклеотидами.

Материал и методы

В работе использованы 12 белых лабораторных мышей линии С57/В1, достигших возраста 4—6 мес. Эксперименты проводили со следованием всем принципам гуманности, содержащихся в директиве Европейского Сообщества (86/609/ЕС), и в соответствии с «Правилами выполнения работ с привлечением экспериментальных животных». Исследования проводились на основании заключения комитета по этике Ордена Трудового Красного Знамени Медицинского института им. С.И. Георгиевского» (протокол заседания комитета по этике №6 от 06.06.2024).

Были выделены две группы по 6 животных: контрольная и экспериментальная. Методика формирования оперативным путем стандартной для исследования модельной ишемизированной раны в межлопаточной области мышам в обеих группах описана в работе Ю.Г. Барановский и соавт. (2016) [8]. Операцию проводили после внутрибрюшинного введения 0,3—0,4 мл 2,5% раствора авертина (трибромэтанола) [6].

Для экспериментальной группы дермальные фибробласты получали с помощью ферментного метода и культивировали в среде DMEM/F12 (Lonza). Клетки второго или третьего пассажа использовали для формирования дермального эквивалента. Дермальный эквивалент был приготовлен на основе коллагена I типа, выделенного из хвостов крыс. Стерильный 0,34 М раствор NaOH объединяли с концентрированной (×10) питательной средой 199 в соотношении 1:1. К полученной смеси добавляли охлажденный раствор коллагена, после чего в среду DMEM/F12 добавляли суспензию фибробластов, содержащую 10% фетальной сыворотки (HyClone). Полученную смесь инкубировали при температуре 37 °С в инкубаторе до полной полимеризации геля [6]. Готовую тканеинженерную конструкцию трансплантировали в ишемизированную кожную рану мышам экспериментальной группы.

В экспериментальной серии модельную рану обкалывали 0,39 мл полидезоксирибонуклеотидами Plenhyage Medium («I.R.A. Istituto Ricerche Applicate Sri», Италия). Препарат вводили инсулиновым шприцем в дно раны и снаружи вокруг силиконового кольца подкожно. Рану у животных обеих групп закрывали асептической повязкой Воскопран с левомиколем и фиксировали узловым швом к краям силиконового кольца.

На 23-й день после операции у мышей всех групп интраоперационно под внутрибрюшинным введением 0,3—0,4 мл 2,5% раствора авертина [8] иссекали образовавшийся рубец и фиксировали глютаральдегидом на фосфатном буфере. Благодаря подвижности кожи у грызунов рану ушивали узловыми швами и после немедикоментозного выхода из наркоза и образования рубца животных возвращали в виварий. Подготовку материала для ультрамикроскопического исследования осуществляли по стандартной методике. Ультратонкие срезы изготавливали на ультратоме УМТП-7 (Украина), контрастировали цитратом свинца и уранилацетатом. Ультратонкие срезы изучали в электронном микроскопе Selmi (Украина) при ускоряющем напряжении 125 kV.

Часть биоптата рубцов фиксировали 10% нейтральным формалином и заливали в парафин [9]. Готовили срезы на микротоме толщиной 7 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином. Толщину эпидермиса, площадь коллагеновых волокон и микрососудов в дерме биоптатов измеряли с помощью программы «ImageJ» при общем увеличении в 400 раз. Нормальность распределения данных проверяли с помощью критерия Шапиро—Уилка [10]. Проводили попарное сравнение контрольной и опытной групп мышей. Поскольку распределение данных отличается от нормального, использовали критерий Манна—Уитни для попарных сравнений, а групповые данные описывали с помощью медианы, первого и третьего квартилей (интерквартильный размах) [11]. Все расчеты проводили в статистической среде R версии 4.2.3 [10]. Достоверность различий принимали при p≤0,05.

Результаты

В контрольной группе силиконовое кольцо у мышей отпало за счет закрытия раны эпидермисом и прорезывания швов на 12,1±0,01-е сутки после операции по моделированию ишемизированного кожного дефекта, а в экспериментальной группе — на 10,4±0,01-е сутки после аналогичной операции и трансплантации дермального эквивалента с дермальными аллофибробластами при поддержке PDRN, т.е. на 22,3% раньше (p≤0,05).

На 23-и сутки заживления ишемизированной раны кожи на спине мышей контрольной группы и на фоне трансплантации дермального эквивалента с дермальными аллофибробластами при поддержке полидезоксирибонуклеотидами кожный дефект эпителизирован полностью. Эпидермис достиг морфологической зрелости. Он имеет базальную мембрану и представляет собой многослойный плоский частично ороговевающий эпителий тонкой кожи, состоящий их четырех сформированных слоев: базального, шиповатого, зернистого и рогового. Однако число рядов эпидермоцитов в шиповатом, зернистом и роговом слоях эпидермиса биоптатов экспериментальной группы значительно больше, за счет чего медиана толщины эпидермиса в этой группе на 50,75% больше, чем в контрольной группе (см. таблицу).

Сравнительная характеристика статистических выборок толщины эпидермиса, удельной площади сосудов и коллагеновых волокон в биоптатах рубцов кожи контрольной и экспериментальной групп на 23-и сутки регенерации ишемизированного кожного дефекта

Примечание. Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха [Q₁; Q₃].

Согласно представленным данным в контрольной и экспериментальной группах толщина эпидермиса составила 63,41 [60,12; 65,22] и 128,75 [120,11; 134,42] мкм соответственно. Из дериватов кожи определяется только шерсть (у мышей волосы, как известно, называют шерстью) по краям биоптатов рубцов кожи мышей экспериментальной группы. Дерму биоптатов в обеих группах составляет фиброзирующаяся грануляционная ткань, находящаяся на третьей стадии раневого процесса. В контрольной группе дерма рубца однородна на всю глубину и состоит из рыхло лежащих коллагеновых волокон без четкой ориентации. В экспериментальной группе в тонкой подэпидермальной области между шерстинками пучки коллагеновых волокон тоньше и сохраняют мелкопетлистое строение. В глубоких областях биоптатов, а также в участках биоптатов без шерстинок коллагеновые волокна толстые и ориентированы параллельно друг другу и базальной мембране эпидермиса. Медиана площади, занимаемой коллагеновыми волокнами, в дерме биоптатов после трансплантации дермального эквивалента с аллофибробластами при поддержке полидезоксирибонуклеотидами на 32,34% выше, чем в контрольной группе (см. таблицу). Васкуляризация биоптатов ишемизированного дефекта кожи экспериментальной группы ниже на 49,8%, что характерно для созревания рубцующейся грануляционной ткани и формирования зрелого нормотрофического рубца (см. таблицу).

При электронно-микроскопическом исследовании биоптатов ишемизированной раны кожи на фоне трансплантации дермального эквивалента с дермальными аллофибробластами при поддержке полидезоксирибонуклеотидами к 23-м суткам регенеративного гистогенеза прослеживаются признаки завершающейся третьей фазы раневого процесса — фазы фиброзирования и ремоделирования рубца. В составе регенерационного гистиона содержатся фибробласты и эозинофилы. На трансмиссионной электронной микрофотографии в рыхлой волокнистой соединительной ткани заметна зона межклеточных взаимодействий между зрелым фибробластом и эозинофильным гранулярным лейкоцитом с сегментированным ядром и специфическими гранулами (рис. 1). Фибробласт имеет вытянутое овальное ядро с преобладающим светлым эухроматином и классическими глыбками гетерохроматина, одним из скоплений которого является перинуклеолярный хроматин с ядрышком. Указанные признаки подтверждают факт сохранения фибробластами функциональной активности, направленной на биосинтез компонентов межклеточного вещества. В цитоплазме хорошо развита гранулярная эндоплазматическая сеть, олпределяются агрегации свободных рибосом на периферии цитоплазмы, митохондрии, резидуальные тельца и вакуоли, что свидетельствует о высоком уровне обменных процессов и биосинтеза белка. Клетка имеет тонкие отростки и ламеллоподии, формирующие вокруг клетки своеобразную зону взаимодействия с окружающим матриксом, который не имеет четкой организации, разволокнен и представлен отдельными пучками коллагеновых протофибрилл.

Рис. 1. Фибробласт и эозинофил в биоптате ишемизированного дефекта кожи после трансплантации дермального эквивалента с дермальными аллофибробластами при поддержке полидезоксирибонуклеотидов. Электронная микрофотография. Ув. ×2000.

1 — фибробласт; 2 — эозинофил; 3 — поперечные и продольные пучки протофибрилл в структуре коллагеновых волокон в межклеточном веществе биоптата.

В составе регенерационного гистиона дермы биоптатов (рис. 2) обнаруживаются относительно редкие клетки — двуядерные фибробласты. У этих клеток оба ядра овальной формы, их ядрышки необычной формы — вытянуты, а перинуклеолярный и маргинальный гетерохроматин представлен в виде единичных гранул. В кариолемме хорошо контурируются ядерные поры, что указывает на высокий уровень биосинтеза белка. Эта функциональная активность фибробластов подтверждается высоким уровнем развития в цитоплазме грануляционной эндоплазматической сети с большим числом митохондрий, свободных рибосом и обширным комплексом Гольджи. Наличие множественных вакуолей на остроконечном и раздваивающихся отростках указывает на активный процесс резорбции отдельных компонентов матрикса, что характеризует процесс ремодуляции рыхлой волокнистой соединительной ткани в зоне трансплантации графта дермального эквивалента с аллофибробластами и полидезоксирибонуклеотидами. В верхней части микрофотографии заметен макрофаг, слева внизу — крупный тканевый базофил на стадии дегрануляции.

Рис. 2. Клетки регенерационного гистиона в биоптате ишемизированной раны кожи после трансплантации дермального эквивалента с дермальными аллофибробластами при поддержке полидезоксирибонуклеотидов.

1 — бинуклеарный фибробласт; 2 — макрофаг; 3 — дегранулирующий базофил; 4 — поперечные и продольные пучки протофибрилл в структуре коллагеновых волокон в межклеточном веществе биоптата. Электронная микрофотография. Ув. ×2000.

Зафиксировано наличие бинуклеарных фибробластов при культивации фибробластов дермы (рис. 3). Это позволяет высказать предположение, что такие клетки обнаружены в биоптатах заживающих ишемизированных кожных дефектов после их трансплантации в составе дермального эквивалента при поддержке полинуклеотидами.

Рис. 3. Мононуклеарные и бинуклеарные (1) дермальные фибробласты третьего пассажа, культивированные в среде DMEM F12. Окраска толуидиновым синим. Ув. ×1800.

Обсуждение

В наших предыдущих исследованиях [12] зафиксировано наличие бинуклеарных активных фибробластов на 12-й день заживления ишемизированной модельной кожной раны на спине мышей после трансплантации аллогенных дермальных фибробластов. Репаративные фибробласты активно синтезируют компоненты межклеточного матрикса грануляционной (репаративной соединительной) ткани при репаративных процессах, регулируют фибро- и ангиогенез [13]. Формирование полинуклеарных фибробластов в результате прямого деления клеточного ядра в отсутствие цитотомии, вероятно, в некоторых ситуациях можно причислить к морфологическим проявлениям компенсаторно-приспособительных реакций, выполняющихся на клеточном уровне [14]. В то же время возможность образования бинуклеарных дермальных фибробластов относят за счет их слияния со стволовыми клетками, имеющими свойство пластичности, проявляющейся в патологических ситуациях, такой как развитие прогрессивного фиброза при формировании рубца [15]. В настоящее время в научном сообществе нет единого мнения о пластичности фибробластов, однако вряд ли можно отрицать существование механизмов, позволяющих им приобретать полиплоидность [16], усиливая их функции, включая способность активно синтезировать компоненты межклеточного вещества рубцовой ткани. Для проявления пластичности in vivo необходимы определенные факторы, выделяемые поврежденным органом, которые мобилизуют стволовые клетки (т.е. вызывают выход стволовых клеток из их естественных ниш в организме и попадание в кровоток) и способствуют колонизации. Одним из таких факторов является фактор SDF-1 и его хемокиновый сигнальный путь CXCL12/CXCR4, который активируется при регенерации кожи [17]. В любом случае, наличие специализированных бинуклеарных фибробластов с признаками высокой функциональной активности наряду с обычными специализированными одноядерными фибробластами у мышей после трансплантации дермального эквивалента с аллогенными фибробластами при поддержке полинуклеотидами является весьма интересным фактом, не описанным ранее.

Заключение

Таким образом, трансплантация дермального эквивалента с дермальными аллофибробластами при поддержке полидезоксирибонуклеотидов в ишемизированную модельную рану на 22,3% ускоряет заживление кожного дефекта. При этом медиана толщины многослойного плоского неороговевающего эпителия эпидермиса на 50,75% больше, медиана площади, занимаемой коллагеновыми волокнами, в дерме биоптатов на 32,34% выше, а медиана площади, занимаемой кровеносными сосудами, меньше на 49,8% по сравнению с таковыми при заживлении модельной раны без лечения. Все эти три показателя демонстрируют статистически значимое отличие экспериментальной группы от контрольной. При электронно-микроскопическом исследовании в регенеративном гистионе дермы биоптатов в сформированной плотной волокнистой неоформленной соединительной ткани экспериментальной группы обнаруживаются бинуклеарные фибробласты, что позволяет им добиться ускоренного заживления обширных дефектов тканей на фоне недостаточности кровообращения.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Барановский Ю.Г., Шаповалова Е.Ю.

Сбор и обработка материала — Барановский Ю.Г., Лугин И.А., Мязина А.В., Барановский А.Г.

Написание текста — Барановский Ю.Г., Ильченко Ф.Н., Лугин И.А., Барановский А.Г.

Редактирование — Заднипряный И.В.

Participation of authors:

Concept and design of the study — Baranovskiy Yu.G., Shapovalova Ye.Yu.

Data collection and processing — Baranovskiy Yu.G., Lugin I.A., Myazina A.V., Baranovskiy A.G.

Text writing — Baranovskiy Yu.G., Ilchenko F.N., Lugin I.A., Baranovskiy A.G.

Editing — Zadnipryany I.V.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.