Рак шейки матки (РШМ) — одна из ведущих онкологических патологий среди женского населения РФ, в структуре смертности от злокачественных новообразований в России РШМ является одной из основных причин смерти женщин в возрасте 30—39 лет [1].

Широкая распространенность и социальная значимость РШМ обусловливают необходимость внедрения в клиническую практику новых методов лечения данного заболевания, одним из которых является иммунотерапия, основанная на лекарственной блокаде взаимодействия PD-1/PD-L1 [2—4].

Препараты-ингибиторы иммунных контрольных точек (ICIs) применяются при лечении пациенток с рецидивирующим или метастатическим РШМ при прогрессировании заболевания во время или после проведения химиотерапии [5, 6]. Клиническая эффективность ICIs при РШМ была изучена в нескольких исследованиях, таких как Keynote 028, Keynote 158 и Checkmate 358 [7—9].

Экспрессия PD-L1 определяется в большинстве местно-распространенных РШМ, а также в рецидивирующих карциномах, обеспечивая тем самым потенциальные терапевтические мишени для иммунотерапевтических препаратов [7, 10, 11]. РШМ — одна из немногих опухолей, для которой в клинических исследованиях ICIs была отмечена предиктивная роль экспрессии PD-L1 [4, 12], однако не все карциномы шейки матки с высоким уровнем экспрессии PD-L1 реагируют на лечение ингибиторами иммунных контрольных точек, в связи с чем представляется интересным изучение связи PD-L1-статуса с другими предиктивными иммунотерапевтическими маркерами, такими как феномен MSI/dMMR. Подобных исследований на сегодняшний день относительно немного, результаты отдельных авторов свидетельствуют, что наличие dMMR в РШМ ассоциировано с более высоким уровнем экспрессии PD-L1 по сравнению с опухолями с pMMR[13].

Предполагается, что уровень экспрессии PD-L1 зависит от гистологического варианта РШМ, отмечается, что для плоскоклеточной карциномы шейки матки позитивный PD-L1-статус более характерен, чем для аденокарциномы или опухоли со смешанной железисто-плоскоклеточной дифференцировкой [14, 15].

Между экспрессией PD-L1 и продуктивной HPV-инфекцией также усматривают прямую связь [16, 17]. Данные ряда авторов [18] свидетельствуют, что для HPV-независимых РШМ характерна слабая экспрессия PD-L1 и, как следствие, отсутствие клинического эффекта от иммунотерапевтического лечения. При HPV-ассоциированных РШМ, напротив, ожидается выраженный ответ на терапию ICIs [19].

Таким образом, в настоящее время представляется актуальным изучение экспрессии PD-L1 в зависимости от клинико-морфологических параметров РШМ с целью определения характеристик, наиболее значимо влияющих на PD-L1-статус опухоли. Важной задачей также является выявление потенциальных связей между уровнем экспрессии PD-L1 и другими предиктивными маркерами иммунотерапии, такими как MSI/dMMR.

Цель исследования, проведенного на базе кафедры патологической анатомии ДПО ФГБОУ РМАНПО, — изучение экспрессии PD-L1 в плоскоклеточном и аденоплоскоклеточном РШМ иммуногистохимическим (ИГХ) методом и оценка связи PD-L1-статуса опухоли с ее клинико-морфологическими характеристиками, TILs, феноменом MSI/dMMR и HPV-статусом опухоли.

Материал и методы

Материалом для исследования послужил 41 образец операционного материала РШМ, предоставленный Рязанским областным онкологическим диспансером. Выборка была проведена случайным образом. Средний возраст пациенток составлял 42,83 года (23—80 лет), распределение по стадиям TNM (UICC, 2018): pT1b— 68,3% (28/41), pT2 — 26,8% (11/41), pT3 — 2,4% (1/41), pT4 — 2,4% (1/41); pN0 — 82,9% (34/41), pN1 — 17,1% (7/41). Карциному in situ и опухоли, определяемые только при микроскопическом исследовании, в данную научную работу не включали. Распределение по степени дифференцировки опухоли было следующим: высокодифференцированные (grade 1) карциномы — 36,6% (15/41), умеренно-дифференцированные (grade 2) — 46,3% (19/41), низкодифференцированные (grade 3) — 17,1% (7/41). Распределение по гистологическому строению опухоли: плоскоклеточные карциномы — 87,8% (36/41), аденоплоскоклеточные раки — 12,2% (5/41), аденокарциному шейки матки в представленное исследование не включали. В 53,7% (22/41) РШМ была обнаружена лимфоваскулярная инвазия, в 46,3% (19/41) карцином признаков сосудистой инвазии не выявлено.

ИГХ-исследования проведены на срезах толщиной 4—5 мкм, изготовленных с парафиновых блоков, ткань в которых была фиксирована в 10% забуференном формалине в течение 24—72 ч. MSI/dMMR определяли ИГХ-методом с использованием антител в рабочем разведении VENTANA anti-MSH2 (G219-1129), VENTANA anti-MSH6 (SP93), VENTANA anti-PMS2 (A16-4), VENTANA anti-MLH1 (M1) с системой детекции OptiView DAB IHC Detection Kit с OptiView Amplification Kit. В случае отсутствия ядерного ИГХ-окрашивания хотя бы одного маркера диагностировали MSI/dMMR. Для исключения ложнонегативных результатов оценивали характер экспрессии внешнего позитивного контроля, в качестве которого использовали нормальную ткань аппендикса и рака сигмовидной кишки с известным высоким уровнем экспрессии белков системы репарации неспаренных оснований ДНК (MMR-системы).

Исследование PD-L1-статуса РШМ проводили ИГХ-методом с использованием набора PD-L1 IHC 22C3 PharmDx («Dako, Inc.») на автостейнере Avtostainer Link 48 (ASL48) («Dako, Inc.»), применяли оптимизированный закрытый протокол, заложенный в автоматизированную платформу. С каждого образца опухоли делали по 2 среза — один для нанесения первичных антител и второй для реагента негативного контроля. В качестве контроля протокола исследования применяли стекла с образцами клеточных культур (NCI-H226 — позитивная клеточная линия и MCF-7 — негативная клеточная линия) и образцы ткани миндалины в каждом цикле постановки реакции. На первом этапе анализа оценивали правильность окрашивания позитивных и негативных клеточных линий и позитивного тканевого контроля (ткань миндалины). Затем проводили оценку ИГХ-реакций на образцах РШМ. Оценивали визуально наличие фактической ИГХ-реакции как в опухолевых, так и в иммунных клетках, в соответствии с рекомендациями по оценке результатов экспрессии PD-L1 оценивали только наличие мембранного окрашивания в опухолевых и иммунных клетках, независимо от его интенсивности. PD-L1-статус РШМ оценивали по системе оценки CPS: отношение опухолевых и иммунных клеток, экспрессирующих PD-L1, ко всем жизнеспособным опухолевым клеткам в образце, умноженное на 100, пороговое значение (cut-off) 1 и более. Помимо PD-L1-статуса, дополнительно определяли уровень экспрессии PD-L1 иммунными и опухолевыми клетками, для данной цели были использованы системы IC и TC соответственно. Показатель IC — это отношение площади, занимаемой иммунными клетками, экспрессирующими PD-L1, к площади опухоли, которая представляет собой совокупность всех жизнеспособных клеток опухоли и иммунных клеток микроокружения, умноженное на 100 и выраженное в процентах. Показатель TC — это доля жизнеспособных опухолевых клеток, демонстрирующих иммуногистохимическую экспрессию PD-L1, среди общего количества опухолевых клеток, выраженная в процентах.

Исследование экспрессии белка p16 проводилось ИГХ-методом с использованием клона E6H4 (Ventana) на срезах, выполненных с парафиновых ТМА-мультиблоков, изготовленных с помощью технологии тканевых матриц (ТМА, tissue microarray). Позитивный HPV-статус РШМ диагностировался при наличии интенсивного диффузного ядерно-цитоплазматического ИГХ-окрашивания белка p16 в непрерывном сегменте клеток. Полное отсутствие экспрессии p16, а также его неоднородное, гетерогенное окрашивание интерпретировались как негативный HPV-статус.

Количественный показатель опухольинфильтрирующих лимфоцитов (tumor-infiltrating lymphocytes, TILs) определяли как отношение площади стромы опухоли, занимаемой мононуклеарными лимфоидными клетками, к общей площади стромы опухоли, выраженное в процентах. «Горячие точки» и лимфоидная инфильтрация за пределами границ инвазивной опухоли, а также в зонах с очагами некроза и артифициальными повреждениями не учитывались при подсчете. Оценка TILs проводилась на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, при использовании увеличения микроскопа в 200—400 раз.

Статистический анализ осуществляли с использованием программы StatTechv. 2.8.8 (разработчик ООО «Статтех», Россия).

Результаты и обсуждение

В нашей работе позитивный PD-L1-статус (CPS ≥1) был определен в 51,2% (21/41) образцов РШМ. Значения CPS в исследуемых карциномах варьировали от 0 до 70, IC — от 0 до 7%, а TC — от 0 до 69%. В части опухолей отмечалась экспрессия PD-L1 преимущественно только опухолевыми клетками, в других — иммунными, в отдельных карциномах наблюдались высокие значения как TC, так и IC (рис. 1).

Рис. 1.Экспрессия PD-L1 в раке шейки матки.

а — экспрессия PD-L1 опухолевыми и иммунными клетками (TC =65%, IC =5%), CPS =70, позитивный PD-L1-статус опухоли; б — экспрессия PD-L1 опухолевыми и иммунными клетками (TC =18%, IC =7%), CPS =25, позитивный PD-L1-статус опухоли; в — экспрессия PD-L1 опухолевыми клетками (TC =40%), отсутствие экспрессии PD-L1 иммунными клетками (IC =0), CPS =40, позитивный PD-L1-статус опухоли; г — отсутствие экспрессии PD-L1 опухолевыми клетками (TC =0), экспрессия PD-L1 иммунными клетками (IC =5%), CPS =5, позитивный PD-L1-статус опухоли.

ИГХ-реакция с антителом к PD-L1 (22C3), ×100.

Большинство исследованных клинико-морфологических характеристик карцином шейки матки, таких как возраст пациенток, гистологический вариант РШМ, стадия pT и pN, наличие лимфоваскулярной инвазии, не влияли на PD-L1-статус опухоли, значения p составили 0,382; 0,663; 0,253; 0,238; 0,062 соответственно (используемые методы: U-критерий Манна—Уитни, точный критерий Фишера, χ² Пирсона). Однако мы отметили, что в плоскоклеточных раках позитивный PD-L1-статус отмечался несколько чаще, чем в группе аденоплоскоклеточных опухолей. Также было показано, что позитивный PD-L1-статус более характерен для карцином с отсутствием метастазов в лимфатических узлах и достоверных морфологических признаков лимфоваскулярной инвазии (рис. 2).

Рис. 2. Анализ связи PD-L1-статуса РШМ с возрастом пациенток (а), гистологическим вариантом опухоли (б), степенью дифференцировки (в), стадией pT (г), лимфоваскулярной инвазией (д) и стадией pN (е).

В нашем исследовании позитивный PD-L1-статус статистически значимо чаще наблюдался в умеренно-дифференцированных РШМ (p=0,027; используемый метод: χ² Пирсона) (см. рис. 2). Более высокая экспрессия PD-L1 опухолевыми клетками (TC) также выявлялась в опухолях умеренной степени злокачественности (p=0,005; используемый метод: критерий Краскела—Уоллиса), для IC подобной связи установлено не было (p=0,343; используемый метод: критерий Краскела—Уоллиса).

В PD-L1-позитивных карциномах шейки матки была более выраженная лимфоидная инфильтрация, чем в опухолях с негативным PD-L1-статусом, данная зависимость оказалась статистически значимой (p=0,038; используемый метод: t-критерий Стьюдента) (рис. 3). С помощью ROC-анализа показано, что позитивный PD-L1-статус РШМ можно ожидать при значении количественного показателя TILs 50% и более. При оценке связи TC и TILs была обнаружена умеренная прямая корреляционная связь (ρ=0,332; p=0,034), между IC и TILs подобная связь также наблюдалась, но теснота ее была охарактеризована как слабая (ρ=0,254; p=0,109)

Феномен MSI/dMMR в представленной выборке был выявлен только в 2 образцах РШМ (4,9%, 2/41), при этом отмечалось отсутствие экспрессии MLH1 и PMS2, а PD-L1-статус указанных карцином был определен как позитивный (рис. 3—5).

Рис. 3. Анализ связи PD-L1-статуса РШМ с TILs, феноменом MSI/dMMR, HPV-статусом и экспрессией белка p16.

Рис. 4. Аденоплоскоклеточный рак шейки матки, G3.

а — окраска гематоксилином и эозином, ×100; б — экспрессия PD-L1 (IC =1%; TC =0, CPS =1); в — отсутствие экспрессии MLH1 в клетках опухоли с сохраненной экспрессией в лимфоидных и стромальных клетках; г — отсутствие экспрессии PMS2 в клетках опухоли с сохраненной экспрессией в лимфоидных и стромальных клетках; д — экспрессия MSH2 в опухолевых, стромальных и лимфоидных клетках; е — экспрессия MSH6 в опухолевых, стромальных и лимфоидных клетках; ж —TMA-блок, окраска гематоксилином и эозином, ×100; з — очаговая экспрессия p16 в плоскоклеточном компоненте опухоли, отсутствие экспрессии p16 в железистом компоненте. б—е, з — ИГХ-реакция, ×100.

Рис. 5. Плоскоклеточный рак шейки матки, G2.

а — окраска гематоксилином и эозином, ×100; б — экспрессия PD-L1 (IC =1%; TC =69%, CPS =70); в — отсутствие экспрессии MLH1 в клетках опухоли (справа) с сохраненной экспрессией в покровном эпителии (слева), лимфоидных и стромальных клетках; г — отсутствие экспрессии PMS2 в клетках опухоли (справа) с сохраненной экспрессией в покровном эпителии (слева), лимфоидных и стромальных клетках; д — экспрессия MSH2 в опухолевых, стромальных, лимфоидных клетках и покровном эпителии; е — экспрессия MSH6 в опухолевых, стромальных, лимфоидных клетках и покровном эпителии; ж — ТМА-блок, окраска гематоксилином и эозином, ×100; з — диффузная экспрессия p16 в клетках опухоли. б—е, з — ИГХ-реакция, ×100.

К сожалению, в рамках данного исследования не удалось обнаружить статистически значимых различий при сопоставлении PD-L1-статуса РШМ в зависимости от характера экспрессии p16 и HPV-статуса опухоли, значения p составили 0,352 и 0,663 (используемые методы: χ² Пирсона и точный критерий Фишера), однако обращает на себя внимание тот факт, что в нашей выборке частота позитивного PD-L1-статуса в группе HPV-ассоциированных карцином была несколько выше по сравнению с группой HPV-независимых раков (см. рис. 3).

Заключение

В нашей работе позитивный PD-L1-статус диагностировался в значительном количестве исследуемых карцином шейки матки (51,2%), независимо от большинства изученных клинико-морфологических характеристик. Полученные результаты показали, что уровень экспрессии PD-L1 в РШМ статистически значимо связан со степенью лимфоидной инфильтрации опухоли, а более высокие уровни экспрессии PD-L1 наблюдаются в умеренно-дифференцированных РШМ. В данной работе феномен MSI/dMMR был определен в малом количестве случаев, однако обращает на себя внимание тот факт, что все опухоли с наличием MSI/dMMR также характеризовались позитивным PD-L1-статусом. Исходя из полученных данных, авторы считают необходимым исследовать PD-L1-статус у пациенток с карциномами шейки матки в целях определения возможности назначения им персонализированной терапии препаратами-ингибиторами иммунных контрольных точек.

Участие авторов:

Концепция и дизайн — Л.Э. Завалишина, Е.М. Олюшина

Сбор и обработка информации — Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, Е.М. Олюшина, Л.В. Москвина

ИГХ-исследование — Л.Э. Завалишина, Е.М. Олюшина, Ю.Ю. Андреева, О.А. Кузнецова

Написание текста — Е.М. Олюшина

Редактирование — Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, Г.А. Франк

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.