В ноябре 2021 г. вышло обновление Классификации опухолей ЦНС ВОЗ (5-е издание), в котором группа эпендимом претерпела ряд серьезных изменений. Если ранее эпендимомы подразделялись по морфологическим критериям и степени злокачественности, то в новой классификации эпендимомы подразделяются в зависимости от локализации (супратенториальные, задней черепной ямки и спинальные), а также молекулярных особенностей [1]. Диагностика эпендимом задней черепной ямки и спинного мозга в большинстве случаев не вызывает затруднений ввиду их яркой морфологической картины и малого количества опухолей схожего гистологического строения. Что же касается опухолей супратенториальной локализации, то они зачастую теряют свою «классическую» морфологию и приобретают дополнительные паттерны (рис. 1), значительно расширяющие дифференциальный ряд, исключение которого иммуногистохимическими (ИГХ) методами затруднено в связи с неспецифичностью фенотипа.

Рис. 1. Микроскопическая картина эпендимом.

а — классическая морфологическая картина; б — веретеноклеточный вариант; в — низкодифференцированный вариант. Окраска гематоксилином и эозином, ×200.

Для многих опухолей ЦНС, включая эпендимомы, описаны молекулярные аберрации, позволяющие облегчать диагностику, а также выделять подгруппы, отличающиеся прогнозом. Так, например, в классификации ВОЗ 2021 г. супратенториальные эпендимомы подразделяются на две подгруппы — со слиянием генов ZFTA и YAP1, причем обнаружение слияний с участием этих генов является обязательным диагностическим критерием. Для определения химерных генов с участием ZFTA и YAP1 рекомендуют использовать различные методы секвенирования, метод интерфазной FISH (флюоресцентная гибридизация in situ, от англ. — fluorescence in situ hybridization), а также метод ПЦР в режиме реального времени. В качестве дополнительных критериев для подтверждения молекулярной подгруппы супратенториальных эпендимом предлагают определение профиля метилирования ДНК.

На сегодняшний день наиболее распространенным и доступным методом дифференциальной диагностики в рутинной практике является ИГХ-метод, однако, он позволяет лишь косвенно судить о слиянии ZFTA::RELA, что и стало поводом для настоящего исследования.

Цель исследования — разработать комплекс молекулярно-генетических тестов для выявления слияний с участием генов ZFTA и YAP1, позволяющий верифицировать супратенториальные эпендимомы.

Материал и методы

В исследование были включены 56 пациентов, проходивших хирургическое лечение в НМИЦ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко по поводу новообразования больших полушарий головного мозга.

Морфологическое исследование

Биопсийный материал был фиксирован 10% забуференным нейтральным формалином, проведен по стандартной методике и залит в парафиновые блоки — FFPE (англ. — formalin-fixed, paraffin-embedded). Из каждого блока были изготовлены препараты, окрашенные гематоксилином и эозином. При гистологическом исследовании препаратов оценивали наличие периваскулярных псевдорозеток и истинных эпендимарных розеток, количество фигур митозов на 10 полей зрения при увеличении в 400 раз, наличие некрозов и пролиферации эндотелия сосудов. На основании результатов гистологического исследования были установлены диагнозы «эпендимома, WHO Grade II» и «анапластическая эпендимома, WHO Grade III», соответствующие супратенториальной эпендимоме, CNS WHO Grade 2, и супратенториальной эпендимоме, CNS WHO Grade 3, согласно 5-му изданию Классификации опухолей ЦНС ВОЗ 2021 г. [1].

Молекулярно-генетическое исследование

Для выявления слияний с участием генов ZFTA и YAP1 разработали тесты на основе ПЦР в режиме реального времени одноцепочечных кДНК, полученных с помощью обратной транскрипции с гибридных мРНК (транскриптов), экспрессирующихся в результате альтернативного сплайсинга гибридных генов: ZFTA::RELA, YAP1::MAMLD1, ZFTA::MAML2, ZFTA::NCOA2, ZFTA::MAML3 и YAP1::FAM118B. Обратную транскрипцию (синтез кДНК) проводили с помощью набора GenPak RT Core (ООО «Лаборатория Изоген»), количество РНК на реакцию составляло 2—200 нг. Были подобраны праймеры, фланкирующие с 5’- и с 3’-концов гибридное соединение двух экзонов в гибридных мРНК, а также разработаны флюоресцентные зонды TaqMan, специфичные непосредственно к стыку двух экзонов.

В случае слияния ZFTA::RELA наиболее частые гибридные варианты мРНК образуются в результате соединения 2-го экзона гена ZFTA и 2-го экзона гена RELA (вариант 2-2), 3-го экзона гена ZFTA и 2-го экзона гена RELA (вариант 3-2), 3-го экзона гена ZFTA и 3-го экзона гена RELA (вариант 3-3), 2-го экзона гена ZFTA и 3-го экзона гена RELA (вариант 2-3) (рис. 2). В случае слияния YAP1::MAMLD1 гибридные варианты мРНК образуются при соединении 5-го экзона гена YAP1 и 3-го экзона гена MAMLD1 (вариант 5-3) и 5-го экзона гена YAP1 и 2-го экзона гена MAMLD1 (вариант 5-2) (рис. 3). В случае слияния YAP1::FAM118B гибридный вариант образуется в результате соединения 7-го экзона гена YAP1 и 3-го экзона гена FAM118B (вариант 7-3) и т.д. (см. рис. 3). В табл. 1 представлены все анализируемые гибридные варианты, а также характеристики разработанных праймеров и зондов TaqMan для их детекции.

Всего для выявления гибридных вариантов с участием генов ZFTA и YAP1 проводили 3 мультиплексные ПЦР-реакции: в первой реакции одновременно анализировали все варианты гибридных мРНК ZFTA::RELA, во второй одновременно анализировали все гибридные варианты YAP1::MAMLD1 и YAP1::FAM118B, в третьей — ZFTA::MAML2, ZFTA::NCOA2, ZFTA::MAML3.

Рис. 2. Детекция различных вариантов слияний ZFTA::RELA методом ПЦР в режиме реального времени.

Одновременная детекция: а — вариантов 2-2 и 3-2; б — варианта 3-2; в — вариантов 2-2, 3-2 и 3-3.

Рис. 3. Детекция различных вариантов слияний YAP1::MAMLD1 и YAP1::FAM118B методом ПЦР в режиме реального времени.

а — детекция варианта 5-3; б — варианта 5-2; в — варианта 7-3.

Таблица 1. Исследуемые слияния с участием генов ZFTA и YAP1 и характеристики используемых праймеров и зондов TaqMan

Для проведения ПЦР-амплификации использовали набор реагентов GenPak PCR Core (ООО «Лаборатория Изоген»), содержащий ингибированную для «горячего старта» Taq ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозид трифосфаты и хлорид магния с конечными концентрациями соответственно 1 ед. акт., 200 мкМ и 2,5 мм, а также оптимизированную буферную систему для проведения ПЦР. Конечный объем ПЦР смеси составлял 20 мкл, а конечная концентрация праймеров и зондов в реакции — 0,1—0,5 мкМ.

ПЦР в режиме реального времени проводили в амплификаторе QuantStudio 5 Applied biosystems (США). Программа амплификации включала несколько стадий:

— предварительная денатурация при 95 °C — 1 мин;

— 50 циклов: 95 °C — 10 с, 50 °C — 10 с (стадия детекции сигнала), 74 °C — 20 с.

РНК из FFPE-образцов опухолевой ткани выделяли с помощью набора реагентов RNeasy FFPE kit (Qiagen, Германия).

Иммуногистохимическое исследование

ИГХ-исследование с моноклональными антителами к белку NF-kb p65/RelA (HUABIO, Китай) проводили на иммуностейнере AutostainerLink 48 (DAKO, Дания) по стандартным протоколам, рекомендованным производителем. Ввиду того что при рекомендованном разведении 1:250 отмечалось выраженное фоновое окрашивание, не позволяющее интерпретировать результаты исследования, титрование было продолжено до соотношения значений 1:1800.

Оценивали ядерную экспрессию во всех полях зрениях в пределах препарата при увеличении в 200 раз. Индекс мечения ядер при анализе экспрессии был условно подразделен на 3 типа: ядерная экспрессия более чем в 70% опухолевых клеток расценивалась как +++, экспрессия от 10 до 70% опухолевых клеток — как ++, а экспрессия менее чем в 10% опухолевых клеток — как + (рис. 4).

Рис. 4. Варианты экспрессии NF-kb p65/RelA в супратенториальных эпендимомах.

а — ядерная экспрессия более чем в 70% клеток (+++); б — ядерная экспрессия в 10—70% клеток (++); в — ядерная экспрессия менее чем в 10% клеток (+). ИГХ-реакция с антителами к NF-kb p65/RelA, ×200.

Результаты

В табл. 2 представлены результаты анализа слияний с участием генов ZFTA и YAP1 на основе разработанного молекулярно-генетического теста. Из 56 образцов супратенториальных эпендимом химерные гены были выявлены в 39 (69,6%) случаях. Из них в 87% (34 пациента) случаев выявлен химерный ген ZFTA::RELA, наиболее характерный для подгруппы супратенториальных эпендимом со слиянием гена ZFTA. У трех пациентов выявлено слияние YAP1::MAMLD1, у одного из пациентов — ZFTA::MAML2 и еще у одного — YAP1::FAM118B. Ни в одном из исследованных образцов не выявлены слияния ZFTA::NCOA и ZFTA::MAML3. У 17 пациентов не удалось обнаружить слияний с участием генов ZFTA и YAP1. В итоге 35 образцов супратенториальных эпендимом на основании молекулярно-генетических свойств были отнесены к подгруппе со слиянием гена ZFTA, 4 образца — к подгруппе со слиянием гена YAP1 и 17 образцов — к подгруппе NOS (без дополнительного уточнения, от англ. — not otherwise specified).

Таблица 2. Частота выявленных слияний с участием генов ZFTA и YAP1 при исследовании методом ПЦР в режиме реального времени

Результаты ИГХ-исследования с моноклональными антителами к белку NF-kb p65, которое позволяет косвенно судить о слиянии генов ZFTA::RELA, представлены в табл. 3. Эта таблица включает результаты для 53 образцов, данные для 3 образцов не включены ввиду отсутствия блоков на момент исследования.

Таблица 3. Результаты ИГХ-исследования с антителами к белку NF-kb p65 пациентов с супратенториальными эпендимомами

Ядерная экспрессия белка NF-kb p65 наблюдалась в 29 (54,6%) образцах и отсутствовала в 24 (45,4%). В иммунопозитивную группу +++ отнесено 5 (9,2%) образцов и по 12 (22,6%) образцов — в группы ++ и +.

26 образцов, которые были проанализированы с помощью обоих методов (ПЦР и ИГХ), дополнительно были верифицированы как супратенториальные эпендимомы, ZFTA- или YAP1-позитивные с помощью анализа метиляционного профиля геномной ДНК опухоли на биочипах Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip kit [4]. Сравнение результатов, полученных с применением всех трех методов, представлено в табл. 4.

Таблица 4. Сравнение результатов анализа метиляционного профиля ДНК, ПЦР и ИГХ для верификации супратенториальных эпендимом

Анализ метиляционного профиля ДНК выявил среди исследованных образцов две клинически значимые молекулярные подгруппы: ZFTA-позитивные супратенториальные эпендимомы (22 образца) и YAP1-позитивные супратенториальные эпендимомы (4 образца). С помощью разработанной методики анализа слияний с участием генов ZFTA и YAP1 на основе ПЦР 18 образцов из этой группы были идентифицированы как ZFTA-позитивные, 4 образца — YAP1-позитивные, в 4 образцах слияний с участием данных генов не выявлено. При ИГХ-исследовании с моноклональными антителами к белку NF-kb p65 установлено только 15 образцов, которые могли быть косвенно отнесены к подгруппе ZFTA-позитивных супратенториальных эпендимом.

Обсуждение

Из приведенных выше результатов следует, что предложенный метод ПЦР в режиме реального времени обладает большей эффективностью по сравнению с методом ИГХ. Немаловажно, что ввиду малых размеров ПЦР-продуктов метод позволяет анализировать сильно деградированную РНК. Высокая степень деградации нуклеиновых кислот очень характерна для используемых в онкологии FFPE-образцов и вносит существенные ограничения в эффективность других методов, например, секвенирования по Сэнгеру.

Наш метод является доступным и экономичным, так как используется мультиплексная ПЦР: анализ 11 вариантов слияний проводится с помощью всего трех ПЦР-реакций. При поиске слияний методом секвенирования по Сэнгеру каждый вариант приходится анализировать в отдельной реакции, что существенно увеличивает время и стоимость.

Стоит отметить, что в нашем исследовании методом ПЦР удалось выявить лишь 82,8% среди заведомо положительных образцов, что свидетельствует о некотором его ограничении. Ввиду сложности процессов перестроек на 11-й хромосоме, в частности, хромотрипсиса (рис. 5), возможно образование слияний ZFTA с другими генами, для поиска которых необходимы дополнительные исследования с использованием метода NGS-секвенирования транскриптома.

Рис. 5. График вариаций числа копий ДНК на 11-й хромосоме, отражающий явление хромотрипсиса: красные точки, расположенные ниже референсного уровня (0 по оси Y), отражают множественные делеции генов.

В случае верификации эпендимом со слиянием ZFTA::RELA на основе ИГХ-исследования мы столкнулись со сложностями при отработке методики, а также последующей интерпретации результатов. Зачастую наблюдали неоднозначную и ложноотрицательную экспрессию в случае малого объема материала. Еще одной сложностью являлось цитоплазматическое окрашивание клеток, вероятно, связанное с локализацией белка p65/RelA, участвующего в пути NF-kb, в цитоплазме в случае неактивности пути. Слияние генов ZFTA::RELA приводит к активации NF-kb и перемещению белка p65/RelA в ядро, однако могут существовать иные пути активации NF-kb, которые дают ложноположительные результаты. С другой стороны, при невыявленном слиянии ZFTA::RELA методом ПЦР в режиме реального времени могут существовать иные слияния генов, вызывающие тот же механизм активации пути NF-kb и дающие положительную ядерную экспрессию. Нельзя исключить, что слияние ZFTA::RELA не всегда приводит к активации пути и перемещению белка p65/RelA в ядро клеток, что может давать ложноотрицательные результаты. В похожем исследовании D. Figarella-Branger и соавт. [5] в 15 образцах из 20 наблюдалась экспрессия, вероятно, соответствующая нашей интерпретации +++; в 3 — слабая экспрессия (++), а в 2 — реакция лишь в немногочисленных ядрах (+). При этом цитоплазматическая экспрессия наблюдалась лишь в 9 образцах, хотя в нашем исследовании цитоплазматическая экспрессия была во всех образцах. По примеру других антител, используемых в нашей практике, мы предполагаем, что это может быть связано с различием иммуностейнеров.

Результаты, полученные в ходе данной работы, согласуются с наблюдениями других исследователей, например, P. Malgulwar и соавт. [6], а также данными 5-го издания классификации опухолей ЦНС ВОЗ.

Заключение

Дифференциальная диагностика супратенториальных эпендимом — сложная задача в клинической практике, имеющая важное значение для определения прогноза и дальнейшей тактики лечения пациентов. Неспецифические клинико-рентгенологические, морфологические признаки и иммунофенотип не позволяют достоверно верифицировать супратенториальные эпендимомы, а применение антитела NF-kb p65, косвенно свидетельствующего о слиянии ZFTA::RELA, дает неоднозначные результаты и вызывает сложности в интерпретации. Исходя из нашего опыта, внедрение молекулярно-генетических методов позволяет верифицировать диагноз и уточнить молекулярную подгруппу для 70% супратенториальных эпендимом, а применение таких быстрых, относительно доступных и легко интерпретируемых методов, как ПЦР в режиме реального времени оптимизирует процесс диагностики.

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект № 21-315-70045)

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Е.Н. Телышева, М.В. Рыжова

Сбор и обработка материала — С.А. Галстян, А.О. Лавринович, Е.Г. Шайхаев, С.К. Горелышев, О.Г. Желудкова, Ю.В. Кушель, Э.В. Кумирова

Статистическая обработка — С.А. Галстян, А.О. Лавринович, Е.Н. Телышева

Написание текста — С.А. Галстян, Е.Г. Шайхаев

Редактирование — Г.П. Снигирева, Е.И. Петрова, М.В. Рыжова

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.