Введение
Разработка нового поколения сильнодействующих низкотоксичных ненаркотических анальгетиков для купирования сильной боли (включая хроническую) в качестве безопасной альтернативы нестероидным противовоспалительным средствам и опиоидам является актуальным направлением фармакологии [1—3]. Основным принципом создания новых лекарственных средств является направленный синтез путем химического модифицирования структуры известных синтетических и природных лекарственных веществ. Разработка эффективных и безопасных инновационных соединений — кандидатов в лекарственное средство для персонифицированной анальгетической терапии крайне актуальна, но требует существенно бо́льших финансовых затрат и более продолжительна. Значительный прогресс в области компьютерного моделирования и прогнозирования, виртуального молекулярного моделирования биологических процессов, технологий направленного химического синтеза усовершенствовал возможность создания оригинальных молекул-кандидатов. Однако результаты, полученные in silico, не всегда транслируются в условиях целостного организма в тестах на животных. Позитивным примером применения компьютерного drug-design для создания нового лекарственного средства является разработка прототипа безопасного мультитаргетного анальгетика «Тиовюрцин, капсулы 120 мг» на основе молекулы first-in-class из класса гексаазаизовюрцитанов [4, 5]. Возможность использования высокоэнергетического вещества — гексаазаизовюрцитана в качестве фармакофора для синтеза новых соединений в дальнейшем подтвердило создание пяти фармакологически активных молекул из 18 впервые синтезированных веществ [5, 6]. Анализ профиля потенциальной биологической активности по расчетам программы PASS (0,826/0,005 — анальгетик, неопиоидный; 0,810/0,005 — обезболивающее действие), исследование острой токсичности (LD50>5000 мг/кг при отсутствии летальности мышей) явились основанием для исследования возможной анальгетической активности одной из таких молекул — 4-(2-этоксиацетил)-2,6,8,10,12пентаацетил2, 4,6,8,10,12гексаазатетрацикло[5,5,0,03,11,05,9]доде-кана [6].
Цель исследования — изучение анальгетической активности впервые синтезированного вещества из класса гексаазаизовюрцитанов в сравнении с трамадолом в батарее поведенческих тестов, характеризующих различные системы ноцицепции («горячая пластина», «уксусные корчи», механическая компрессия лапы по Randall—Selitto).
Материал и методы
Эксперименты были выполнены на 182 мышах-самцах стока CD1 (масса тела 28—32 г), конвенциональных, 1-й категории, полученных из отдела экспериментального биомоделирования Научно-исследовательского института фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук». Содержание животных и дизайн экспериментов были одобрены комиссией по биоэтике Научно-исследовательского института фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга (протокол JACUC №19212021 от 21 декабря 2021 г.) и соответствовали директиве 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях; ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики», 01.08.2015.
Распределение на группы осуществляли рандомизированно, используя в качестве критерия массу тела (±10%), в каждой группе было не менее 10 животных. Эвтаназию животных проводили в CO2-камере.
Объектом исследования является 4-(2-этоксиацетил)-2,6,8,10,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,03,11,05,9]додекан (далее — М1) (рисунок) — бесцветный кристаллический продукт с содержанием основного вещества 99,01% (метод высокоэффективной жидкостной хроматографии), хорошо растворим в воде, этаноле. Характеристика подтверждена физико-химическими методами исследования: ИК-спектр, ν/см–1, спектр ядерного магнитного резонанса (ЯМР) 1Н (ДМСО-d, δ, м.д.), спектр ЯМР С (ДМСО-d6, δ, м.д.).
Структурная формула вещества М1.
Изучение анальгетической активности вещества М1 проводили в соответствии с «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [7]. Вещество в диапазоне доз 25—200 мг/кг и препарат сравнения трамадол (ОАО «Органика») в дозе 10 мг/кг вводили в желудок мыши через атравматичный зонд ежедневно в течение 1—3 сут в объеме 0,2 мл растворителя на 20 г тела мыши, последнее введение осуществляли за 1 ч до тестирования болевой чувствительности мышей. Дозы и путь введения исследуемого вещества были выбраны на основании ранее проведенных пилотных экспериментов по исследованию специфической фармакологической активности. Расчет дозы препарата сравнения для мышей осуществляли с учетом коэффициентов межвидового переноса доз с последующим подтверждением в экспериментах [3, 4]. Мыши группы негативного контроля получали эквиобъемные количества растворителя (воду ампульную) при аналогичном пути и режиме введения. Тестирование животных проводили через 1 ч и 2 ч после последнего введения вещества М1 и препарата сравнения.
На первом этапе исследования, в тесте «уксусные корчи», моделирующем острую висцеральную и соматически глубокую боль, анальгетический эффект вещества М1 оценивали по его способности при превентивном трехсуточном введении (в течение 15 мин после внутрибрюшинной инъекции 0,75% раствора уксусной кислоты в количестве 0,1 мл на 10 г массы тела мышей) снижать (в %) количество «корчей» по сравнению с группой негативного контроля [7—9].
На втором этапе исследования обезболивающую активность вещества М1 исследовали при его превентивном однократном введении на модели термического раздражения, основанной на регистрации поведенческих реакций, контролируемых супраспинальными структурами [7, 8]. После помещения мыши на пластину прибора Hotplate Analgesia Meter (Columbus Instruments, USA), нагретую до 54,00±0,5 °С, с достижением порога болевой чувствительности регистрировали латентное время (с) болевой реакции (терминальная точка — облизывание подушечек задних лап).
Критерием анальгетического эффекта считали эффективность по показателю МВЭ (максимально возможный эффект) в %: МВЭ=(ЛПо–ЛПк)/(30–ЛПк)×100%, где ЛПо — латентный период ноцицептивной реакции в опытной группе; ЛПк — латентный период ноцицептивной реакции в контрольной группе; 30 — максимальное время (в секундах) экспозиции для мышей без проявления болевой реакции.
В тесте механической компрессии лапы использовали анальгезиметр (Ugo Basile, Италия) для оценки порога болевой чувствительности по методу Randall—Selitto [7—9]. Критерием анальгетического эффекта считали статистически значимое уменьшение интенсивности болевых реакций, оцененной (в г) по силе воздействия на лапу, латентному времени развития болевой реакции (c), числу животных без болевой реакции в течение 15 с в анальгезиметре.
Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета программ Statistica 10. Распределение полученных величин отличалось от нормального (в соответствии с критерием Шапиро—Уилка), поэтому для множественного сравнения применяли критерий Краскела—Уоллиса; для межгруппового сравнения использовали U-критерий Уилкоксона—Манна—Уитни, для выявления уровня значимости различий качественных показателей — критерий углового преобразования Фишера (φ). Для каждой выборки вычисляли среднее арифметическое значение признака (M) и стандартную ошибку среднего (m), которые вместе со значением n (количество вариантов) представлены в итоговых таблицах. Во всех случаях нулевую гипотезу отвергали при p<0,05 [10].
Результаты
Как видно из табл. 1, на фоне развившейся острой висцеральной боли у мышей вещество М1 после трехсуточного внутрижелудочного введения в диапазоне доз 25—200 мг/кг оказывало антиноцицептивное действие, сравнимое с высокой активностью трамадола. Подавление болевой реакции на 41% у животных, получавших вещество М1 в дозе 25 мг/кг, выражалось в снижении количества «корчей» в 1,7 раза (p<0,05) в сравнении с негативным контролем.
Таблица 1. Показатели ноцицепции у мышей-самцов стока CD1 после трехсуточного внутрижелудочного введения вещества М1 и трамадола на модели химического болевого раздражения брюшины
| Группа наблюдения, доза (количество животных в группе) | Количество «корчей» за 15 мин, M±m | Латентное время развития «корчей», M±m, с | Угнетение болевой реакции, % |
| Тестирование через 1 ч после последнего введение веществ | |||
| 1. Контроль (n=10) | 22,5±2,8 | 218±9 | — |
| 2.Трамадол, 10 мг/кг (n=10) | 11,1±1,9 1—2** | 298±21 1—2** | 51 |
| 3. М1, 25 мг/кг (n=10) | 13,3±2,9 1—3* | 254±29 | 41 |
| 4. М1, 50 мг/кг (n=10) | 5,7±1,3 1—4** 2—4* | 401±61 1—4** | 75 |
| 5. М1, 100 мг/кг (n=10) | 8,1±2,6 1—5** | 399±64 1—5** | 64 |
| 6. М1, 200 мг/кг (n=10) | 9,0±2,9 1—6** | 516±105 1—6** | 60 |
Примечание. Здесь и в табл. 2, 3: * — p<0,05, ** — p<0,01. Перед уровнем значимости указаны номера сравниваемых групп.
Введение вещества в дозе 50 мг/кг приводило не только к уменьшению числа «корчей» в 3,9 раза (p<0,01), но и к повышению латентного времени болевой реакции в 1,8 раза (p<0,01) относительно соответствующего значения контроля. Максимальный эффект вещества М1 (75%) в дозе 50 мг/кг превосходил активность трамадола, судя по снижению числа «корчей» в 1,9 раза (p<0,05) относительно показателя референс-препарата. При повышении дозы вещества до 100 мг/кг и 200 мг/кг отмечалась некоторая тенденция к снижению эффекта (см. табл. 1). Однако в этих группах выявлено как уменьшение количество «корчей» в 2,8 раза (p<0,01) и в 2,5 раза (p<0,01), так и увеличение периода развития болевого ответа в 1,8 раза (p<0,01) и в 2,4 раза (p<0,01) соответственно относительно показателей негативного контроля.
Результаты эксперимента при трехсуточном внутрижелудочном введении вещества М1 в тесте «уксусные корчи» обусловили целесообразность дальнейшего исследования вещества М1 при однократном введении в тестах центрального болевого генеза с термическим и механическим воздействием (табл. 2, 3).
Таблица 2. Показатели ноцицепции у мышей-самцов стока CD1 при однократном внутрижелудочном введении вещества М1 в сравнении с трамадолом в тесте термической соматической боли
| Группа наблюдения, доза (количество животных в группе) | Латентный период развития болевой реакции, M±m, с | Количество мышей с экспозицией 30 с, % | Максимально возможный эффект, % | Латентный период развития болевой реакции, M±m, с | Количество мышей с экспозицией 30 с, % | Максимально возможный эффект, % |
| Через 1 ч после введения | Через 2 ч после введения | |||||
| 1. Контроль (n=10) | 21,4±1,7 | 10 (1/10) | 0 | 20,4±2,1 | 10 (1/10) | 0 |
| 2. Трамадол, 10 мг/кг (n=10) | 24,2±2,3 | 30 (3/10) | 32,6 | 27,5±1,6 1—2** | 70 (7/10) 1—2** | 74 |
| 3. М1, 25 мг/кг (n=10) | 26,4±1,3 1—3* | 50 (5/10) 1—3** | 58,1 | 29,5±0,6 1—3** | 90 (9/10) 1—3** | 95 |
| 4. М1, 50 мг/кг (n=10) | 24,3±1,9 | 30 (3/10) | 33,7 | 28,0±1,2 1—4** | 60 (6/10) 1—4** | 79 |
| 5. М1, 100 мг/кг (n=10) | 22,6±1,8 | 30 (3/10) | 14,0 | 27,3±1,2 1—5** | 30 (3/10) 2—5** 3—5** | 72 |
| 6. М1, 200 мг/кг (n=10) | 24,33±2,33 | 40 (4/10) 1—6* | 33,7 | 26,6±1,4 1—6** | 60 (6/10) 1—6** | 65 |
Таблица 3. Показатели ноцицепции у мышей-самцов стока CD1 при однократном внутрижелудочном введении вещества М1 в сравнении с трамадолом в тесте механической компрессии лапы по методу Randall—Selitto
| Группа наблюдения, доза (количество животных в группе) | Сила воздействия на лапу (болевой порог), M±m, г | Латентное время развития болевой реакции, M±m, с | Количество мышей без болевой реакции в течение 15 с, % |
| 1. Контроль (n=10) | 263,5±44,2 | 5,1±1,0 | 0 |
| 2. Трамадол, 10 мг/кг (n=11) | 468,2±74,0 1—2* | 9,6±1,5 1—2* | 30 (3/11) 1—2** |
| 3. М1, 25 мг/кг (n=11) | 399,8±67,3 | 8,2±1,5 | 30 (3/11) 1—3** |
| 4. М1, 50 мг/кг (n=10) | 412,7±84,0 | 8,3±1,5 | 20 (2/10) 1—4** |
| 5. М1, 100 мг/кг (n=10) | 516,2±70,5 1—5** | 10,5±1,5 1—5** | 40 (4/10) 1—5** |
| 6. М1, 200 мг/кг (n=10) | 463,1±82,4 1—6** | 9,5±1,7 1—6* | 40 (4/10) 1—5 ** |
В тесте «горячая пластина» антиноцицептивное действие трамадола реализовывалось через 2 ч после введения, показатели болевой реакции животных в этой группе представлены в табл. 2. Исследуемое вещество М1 в дозе 25 мг/кг через 1 ч после введения статистически значимо повышало латентный период развития болевой реакции и количество животных с экспозицией 30 с до 5/10 (p<0,01) против 1/10 в контроле. Эффект вещества М1 в дозе 200 мг/кг характеризовался отсутствием болевого ответа у 4 из 10 мышей (p<0,05). Через 2 ч наблюдения вещество М1 во всем диапазоне доз 25—200 мг/кг проявляло обезболивающую активность, сравнимую с действием трамадола. Максимальный обезболивающий эффект вещества М1 установлен в дозе 25 мг/кг (МВЭ=94,9%): латентное время развития болевого ответа превышало значение контроля в 1,4 раза (p<0,01), а количество мышей с экспозицией 30 с увеличилось до 9/10 (90%, p<0,01) против 1/10 в контроле.
Анальгетическое действие вещества М1 в остальных дозах реализовывалось в повышении латентного времени развития болевой реакции в 1,4 раза (50 мг/кг, p<0,01), в 1,3 раза (100 мг/кг, p<0,01; 200 мг/кг, p<0,01) относительно соответствующего значения водного контроля. Кроме того, в группах применения вещества М1 в дозах 50 мг/кг и 200 мг/кг количество мышей с экспозицией 30 с было сопоставимым с соответствующим показателем трамадола.
На модели механической гипералгезии по Randall—Selitto трамадол через 1 ч после однократного введения проявлял выраженную анальгетическую активность, числовые данные которой представлены в табл. 3.
Антиноцицептивное действие вещества М1 в дозах 25 мг/кг и 50 мг/кг выражалось в статистически значимом повышении количества животных без вокализации и проявления беспокойства в течение 15 с экспозиции. Увеличение дозы вещества М1 до 100 мг/кг и 200 мг/кг приводило к более эффективному снижению болевой чувствительности мышей к компрессионной боли. Выявлено увеличение порога болевой чувствительности в 2,0 раза (100 мг/кг, p<0,05) и 1,8 раза (200 мг/кг, p<0,05), латентного времени развития болевой реакции в 2,1 раза (100 мг/кг, p<0,01) и 1,9 раза (200 мг/кг, p<0,05), снижение количества мышей без болевой реакции до 4/10 (40%, p<0,01) в обеих группах.
Обсуждение
Тесты механического, термического и химического болевого раздражения различаются генезом возникновения, системой ноцицепции, путем проведения нервного импульса и его восприятия, что было использовано в качестве критерия для выявления обезболивающего профиля и эффективности исследуемого анальгетика [8, 9]. Каждая модель оценки соматогенной болевой чувствительности характеризуется хорошо изученным механизмом восприятия ноцицептивного стимула, что позволяет при выявлении анальгетической активности новой молекулы, главным образом на начальном этапе изучения, предполагать возможное рецепторное взаимодействие для планирования дальнейшего доклинического исследования [7—9].
В тесте «уксусные корчи», характеризующем центральный и периферический механизмы организации болевой чувствительности, исследуемое вещество в дозе 50 мг/кг превосходило антиноцицептивное действие трамадола. Учитывая патогенез развития боли при химическом раздражении брюшины, можно предположить, что эффект вещества М1 может быть опосредован как через активацию опиоидергической системы, так и через ингибирование синтеза простагландинов.
Нами выявлено на модели «горячая пластина», характеризующей супраспинальный уровень болевой чувствительности с вовлечением корковых и подкорковых структур головного мозга, выраженное антиноцицептивное действие вещества М1 в динамике исследования, тогда как трамадол проявлял сопоставимый эффект только во второй срок наблюдения. Предполагаемый механизм реализации антиноцицептивного действия вещества М1 на супраспинальном уровне не исключает возможности блокады TRPV1-рецептора, который активируется в ответ на термический стимул [7, 9].
Установлено, что в тесте механической компрессии лапы по Randall—Selitto с преимущественным супрасегментарным уровнем замыкания рефлекса и вовлечением периферических механизмов ноцицепции [7, 9] вещество М1 было сопоставимо по обезболивающей активности с трамадолом.
Выбор в качестве референс-препарата трамадола со смешанным механизмом анальгетического действия подтверждает правомерность вывода о высокой анальгетической активности вещества М1. Совокупность представленных нами результатов свидетельствует о реализации выявленной активности вещества М1 на различных уровнях проведения и модуляции ноцицептивной чувствительности с вовлечением сложноорганизованной системы сегментарных, супрасегментарных и периферических нейрофизиологических механизмов боли.
Заключение
Результаты исследования подтверждают данные, полученные in silico, о выраженной анальгетической активности впервые синтезированного соединения из класса гексаазаизовюрцитанов (вещества М1). Полученные экспериментальные данные являются основанием для вывода о смешанном типе рецепторного реагирования указанного вещества на моделях с различным профилем болевого раздражения, что позволяет отнести его к перспективным кандидатам с высоким анальгетическим терапевтическим потенциалом для дальнейших доклинических исследований.
Финансирование. Данная работа выполнена в рамках реализации темы государственного задания №122020200058-6: «Поиск, разработка и изучение механизмов действия синтетических и природных биологически активных субстанций, полученных в том числе на основе биотехнологий, для фармакологической коррекции различных патологических процессов».
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.