Введение
Влиянию возраста на интенсивность восприятия боли посвящена огромная и все возрастающая по своим масштабам литература. Однако до сих пор остается много вопросов, требующих дальнейшего изучения. Слишком много противоречивых сообщений о влиянии возраста на боль. При диагностике и лечении целого ряда болевых синдромов необходимо учитывать особенности болевого восприятия у людей разного возраста. Лечение пожилого пациента с болью имеет ряд особенностей по сравнению с терапией больных более молодого возраста и является одной из актуальнейших проблем нейрогериатрии. Доклинические и клинические исследования показали, что особенности восприятия боли в разных возрастных группах являются результатом анатомических, физиологических и биохимических изменений, влияющих на механизмы нейропластичности и нейроиммуногуморальную регуляцию. Возрастные изменения в ноцицептивной и антиноцицептивной системах приводят к тому, что хроническая боль в старших возрастных группах имеет более сложную клиническую структуру [1, 2]. У пожилых людей в периферических нервах усиливаются процессы валлеровской дегенерации миелинизированных и немиелинизированных волокон. Число и размер сенсорных нейронов в ганглиях задних корешков также уменьшаются [1, 3—6]. Возрастное уменьшение числа периферических волокон, наличие демиелинизации и признаков нейрогенного воспаления напоминают патологические изменения при полиневропатиях. В этом заключается сходство между нейроанатомическими изменениями, лежащими в основе невропатической боли у молодых пациентов, и возрастными изменениями в ноцицептивной системе пожилых людей [1, 3—6]. Аналогичные изменения происходят и в процессе старения животных.
Ранее нами было показано, что у крыс линии Вистар (Wistar) в возрасте 3 мес введение пентилентетразола (ПТЗ) в субсудорожной дозе 15 мг/кг оказывало проноцицептивное действие только через 24 ч, а в судорожной дозе 60 мг/кг — антиноцицептивное действие в течение всего периода наблюдения [7].
Цель настоящего исследования — продолжение изучения особенностей изменения болевой чувствительности у этих же животных в возрасте 10 и 18 мес.
Материал и методы
Эксперименты выполнены на крысах самцах линии Вистар в возрасте 10 мес (n=45) массой 400—500 г и в возрасте 18 мес (n=37) массой 450—550 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище. Все процедуры и эксперименты на животных проводили в соответствии с «Правилами надлежащей лабораторной практики», утвержденными Приказом Министерства здравоохранения РФ от 01.04.16 №199н, и Межгосударственными стандартами ГОСТ 33215—2014, ГОСТ 33216—2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными», соответствующими Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментах и в других научных целях (ETS N 123, Страсбург, 18 марта 1986 г. с Приложением от 15.06.06), а также в соответствии с требованиями Международной ассоциации по изучению боли и Директивы Совета Европейского сообщества (86/609/ЕЕС). Исследования проводили под контролем этического комитета ФГБНУ «НИИОПП».
Проведено 2 серии опытов по одной и той же схеме на одних и тех же животных с интервалом в 8 мес. Во всех сериях опытов ПТЗ вводили однократно внутрибрюшинно в субсудорожной дозе 15 мг/кг и в судорожной дозе 60 мг/кг. Контрольным животным такого же возраста в аналогичных условиях опыта вводили физиологический раствор.
Тяжесть судорожной реакции на введение ПТЗ оценивали по общепринятой шкале и выражали ее в баллах: 1 — вздрагивание или кивание головы; 2 — редкие (отдельные) клонические судороги всего тела; 3 — серия клонических судорог всего тела или клонус передних конечностей; 4 — тонико-клонические судороги с подъемом на задние конечности (поза «кенгуру»); 5 — клонико-тонические судороги с падением животного на бок и фазой тонической экстензии и/или гибель животного [8]. Порог болевой чувствительности (ПБЧ) у животных определяли до введения ПТЗ, а также через 30 мин, 24 ч и 6 дней после его введения.
Измерения ПБЧ у животных проводили с помощью теста горячей пластины (hot plate) на приборе TSE Systems (Германия), который используется для определения особенностей регуляции болевой чувствительности на уровне центральных структур мозга. Величина ПБЧ измерялась в секундах по латентному периоду, через которое животное, находящееся на нагретой до 55 °C металлической пластине, начинало облизывать лапу, подпрыгивать или выпрыгивать. Животных, не проявляющих болевого поведения в течение 40 с, убирали с горячей поверхности во избежание теплового повреждения подушечек лап. В этом случае ПБЧ приравнивали к 40 с. Принимая во внимание тот факт, что болевой порог у грызунов подвержен циркадным колебаниям, оценку ноцицепции проводили в одно и то же время, в светлую фазу суток (13:00—16:00).
Статистическую обработку данных осуществляли по алгоритмам программы Statistica 8.0. Оценку значимости показателей и различий рассматриваемых выборок проводили по U-критерию Манна—Уитни для независимых выборок и по T-критерию (парному критерию Уилкоксона) для связанных выборок. В качестве средневыборочной характеристики использовали медиану (Ме), первый и третий квартили (Q1; Q3). Достоверными считали различия между группами при p<0,05.
Результаты и обсуждение
В 1-й серии опытов у животных в возрасте 10 мес однократное введение ПТЗ в субсудорожной дозе 15 мг/кг не приводило к изменению ПБЧ в тесте hot plate (табл. 1). Введение ПТЗ в дозе 60 мг/кг вызывало судороги тяжестью 4—5 баллов у всех животных и приводило к увеличению ПБЧ через 30 мин на 174,71% (p=0,0076), через 24 ч на 13,73% (p=0,025) и через 6 дней на 56,86% (p=0,035). У контрольных животных этой серии в аналогичных условиях опыта введение физиологического раствора не влияло на ПБЧ (см. табл. 1).
Таблица 1. Изменение порога болевой чувствительности у крыс линии Вистар в возрасте 10 мес после введения ПТЗ в дозах 15 и 60 мг/кг в тесте hot plate, Me (Q1; Q3)
| Период | Физраствор, n=9 | ПТЗ 15 мг/кг, n=9 | ПТЗ 60 мг/кг, n=9 |
| ЛП (с) | ЛП (с) | ЛП (с) | |
| До введения препаратов | 4,8 (4,2; 5,7) | 4,4 (3,9; 5,0) | 5,1 (4,2; 6,3) |
| 30 мин после введения препаратов | 4,2 (3,1; 5,3) | 3,6 (2,1; 4,7) | 14,01 (7,8; 30)*** + ## 0 ^ |
| 24 ч после введения препаратов | 4,3 (4,0; 6,2) | 4,8 (4,5; 3,0) | 5,8 (5,3; 7,4)** |
| 6 дней после введения препаратов | 5,1 (3,0; 7,0) | 4,75 (3,0; 5,9) | 8,0 (5,7; 8,5)* # |
Примечание. ЛП — латентный период появления болевой реакции; ***p=0,0076, **p=0,025, *p=0,035 по сравнению с соответствующими показателями до введения препаратов; 0p=0,011 по сравнению с соответствующими показателями через 24 ч после введения препаратов; ^p=0,011 по сравнению с соответствующими показателями через 6 дней после введения препаратов; +p=0,00017 по сравнению с соответствующими показателями группы с введением физиологического раствора; ##p=0,00024, #p=0,024 по сравнению с соответствующими показателями группы с введением ПТЗ в дозе 15 мг/кг.
Во 2-й серии опытов у этих же животных в возрасте 18 мес введение ПТЗ в дозе 15 мг/кг приводило к снижению ПБЧ на протяжении всего периода наблюдения (табл. 2). Через 30 мин после введения ПБЧ был ниже на 50% (p=0,028), через 24 ч и 6 дней — на 66,67% (p=0,012) и 50% (p=0,011) соответственно. Введение ПТЗ в дозе 60 мг/кг вызывало судороги тяжестью 4—5 баллов у всех животных и приводило к увеличению ПБЧ только через 30 мин после введения ПТЗ — на 83,33% (p=0,044). Через 24 ч и 6 дней ПБЧ не отличался от значений до введения ПТЗ (см. табл. 2). У контрольных животных, как и в 1-й серии опытов, введение физиологического раствора не оказывало влияния на ПБЧ.
Таблица 2. Изменение порога болевой чувствительности у крыс линии Вистар в возрасте 18 мес после введения ПТЗ в дозах 15 и 60 мг/кг в тесте hot plate, Me (Q1; Q3)
| Период | Физраствор, n=9 | ПТЗ 15 мг/кг, n=9 | ПТЗ 60 мг/кг, n=9 |
| ЛП (с) | ЛП (с) | ЛП (с) | |
| До введения препаратов | 7,0 (5,0; 9,0) | 6,0 (5,0; 7,0) | 6,0 (5,9; 7,0) |
| 30 мин после введения препаратов | 8,0 (4,5; 9,0) | 3,0 (3,0; 4,0)* ++ | 11,0 (8,0; 15,0)* + 0 ^ ### |
| 24 ч после введения препаратов | 6,0 (5,5; 8,5) | 2,0 (2,0; 5,0)*** +++ | 6,0 (4,0; 6,0)# |
| 6 дней после введения препаратов | 4,2 (2,5; 7,0) | 3,0 (2,5; 3,0)*** | 4,0 (4,0; 7,0)## |
Примечание. ЛП — латентный период появления болевой реакции; ***p=0,01, **p=0,028, *p=0,044 по сравнению с соответствующими показателями до введения препаратов; 0p=0,029 по сравнению с соответствующими показателями через 24 ч после введения препаратов; ^p=0,021 по сравнению с соответствующими показателями через 6 дней после введения препаратов; +++p=0,0061, ++p=0,01, +p=0,038 по сравнению с соответствующими показателями группы с введением физиологического раствора; ###p=0,00046, ##p=0,0055, #p=0,022 по сравнению с соответствующими показателями группы с введением ПТЗ в дозе 15 мг/кг.
Для анализа особенностей возрастных изменений ПБЧ в настоящем исследовании были привлечены данные, полученные нами ранее в тесте hot plate на животных 3-месячного возраста [7]. У этих животных введение субсудорожной дозы ПТЗ оказывало проноцицептивное действие только через 24 ч после введения ПТЗ, а в судорожной дозе — антиноцицептивное действие в течение всего периода наблюдения (6 дней). В возрасте 10 мес субсудорожная доза ПТЗ не влияла на ПБЧ, а введение ПТЗ в судорожной дозе также вызывало антиноцицептивное действие в течение всего периода наблюдения (6 дней) (табл. 1, рис. 1, 2). В возрасте 18 мес субсудорожная доза ПТЗ оказывала проноцицептивное действие в течение всего периода наблюдения (6 дней), а судорожная доза — кратковременное антиноцицептивное действие только через 30 мин после введения ПТЗ.
Рис. 1. Динамика изменения порога болевой чувствительности (ПБЧ) у крыс самцов линии Вистар в возрасте 3, 10 и 18 мес после введения ПТЗ в дозе 15 мг/кг.
По оси абсцисс — ПБЧ в секундах; по оси ординат — время до введения ПТЗ, а также через 30 мин, 24 ч и 6 дней после его введения.
**p=0,00071, *p=0,00081 по сравнению с соответствующими показателями в возрасте 3 мес; +++p=0,0013, ++p=0,0033, +p=0,012 по сравнению с соответствующими показателями в возрасте 3 мес; ##p=0,0026, #p=0,043 по сравнению с соответствующими показателями в возрасте 10 мес.
Рис. 2. Динамика изменения порога болевой чувствительности (ПБЧ) у крыс самцов линии Вистар в возрасте 3, 10 и 18 мес после введения ПТЗ в дозе 60 мг/кг.
По оси абсцисс — ПБЧ в секундах; по оси ординат — время до введения ПТЗ, а также через 30 мин, 24 ч и 6 дней после его введения.
*p=0,0055 по сравнению с соответствующими показателями в возрасте 3 мес; +p=0,01 по сравнению с соответствующими показателями в возрасте 3 мес.
Полученные данные свидетельствуют о возрастзависимом изменении ПБЧ. Так, введение субсудорожной дозы ПТЗ у 3-месячных животных оказывало кратковременное проноцицептивное действие только через 24 ч после введения, а у 18-месячных животных проноцицептивное действие наблюдали в течение всего периода наблюдения (6 дней). Следует отметить, что в возрасте 18 мес снижение ПБЧ было более выраженным, чем в возрасте 3 мес: через 30 мин ПБЧ был ниже на 58,9% (p=0,0013), через 24 ч и 6 дней — на 60% (p=0,0033) и 43,4% (p=0,012) соответственно (рис. 1). Характер изменения ПБЧ у крыс с возрастом при введении судорожной дозы ПТЗ также менялся. У животных 3-месячного и 10-месячного возраста введение судорожной дозы ПТЗ оказывало антиноцицептивное действие в течение всего периода наблюдения (6 дней), а у животных в возрасте 18 мес антиноцицептивное действие наблюдали только в течение 30 мин после введения ПТЗ (рис. 2).
Сравнительный анализ исходных значений ПБЧ у животных до введения препаратов (ПТЗ и физиологического раствора) также свидетельствует о возрастзависимых изменениях. Исходные значения ПБЧ в группе с введением ПТЗ в субсудорожной дозе у животных в возрасте 10 мес были ниже на 34,14% по сравнению с животными 3-месячного возраста (p=0,00071) (рис. 1) и на 16,52% (p=0,031) в группе с введением физиологического раствора (рис. 3). У животных в возрасте 18 мес в группе с введением субсудорожной дозы исходные значения ПБЧ до введения ПТЗ не отличались от исходных значений ПБЧ у животных в возрасте 3 мес и были ниже на 36,36% (p=0,026) исходных значений ПБЧ у животных в возрасте 10 мес (рис. 1). В группе с введением физиологического раствора у крыс в возрасте 18 мес исходные значения ПБЧ статистически значимо не отличались от исходных значений ПБЧ у животных в возрасте 3 и 10 мес (рис. 3). В группе с введением судорожной дозы ПТЗ возрастзависимого изменения исходных значений ПБЧ не выявлено (рис. 2).
Рис. 3. Динамика изменения порога болевой чувствительности (ПБЧ) у крыс самцов линии Вистар в возрасте 3, 10 и 18 мес после введения физиологического раствора.
По оси абсцисс — ПБЧ в секундах; по оси ординат — время до введения физиологического раствора, а также через 30 мин, 24 ч и 6 дней после его введения.
**p=0,0028, *p=0,0031 по сравнению с соответствующими показателями в возрасте 3 мес; #p=0,020 по сравнению с соответствующими показателями в возрасте 10 мес.
Следует отметить, что при увеличении количества повторных тестирований менялось поведение животных. Так, при помещении на горячую пластину, ограниченную прозрачным пластиковым цилиндром, животные чаще из него выпрыгивали. В группе с введением физиологического раствора при исходном тестировании в возрасте 3 мес выпрыгивало 25% крыс, в возрасте 10 мес — 90,90% (p=0,025), в возрасте 18 мес — 37,50%. В группе с введением субсудорожной дозы ПТЗ при исходном тестировании в возрасте 3 мес выпрыгивало 9,09% животных, в возрасте 10 мес — 80% (p=0,025), в возрасте 18 мес — 55,50%. В группе с введением судорожной дозы ПТЗ число выпрыгнувших животных при исходном тестировании до введения ПТЗ существенно не отличалось в различные возрастные периоды (33,33% — в возрасте 3 мес, 44,44 и 33,33% — в возрасте 10 и 18 мес соответственно). Таким образом, при проведении повторных тестирований у животных может сохраняться память на болевой стресс.
Ранее для анализа особенностей возрастных изменений ПБЧ у животных нами были проведены исследования с использованием теста отдергивания хвоста (tail flick) [9]. Как известно, тесты hot plate и tail flick являются моделями острого болевого воздействия и оба типа стимулов вызывают боль путем теплового раздражения тканей. Считается, что на модели tail flick отдергивание хвоста реализуется посредством спинальных и бульбоспинальных рефлексов, в то время как на модели hot plate включается дополнительная супраспинальная модуляция [10, 11].
В тесте hot plate введение субсудорожных доз ПТЗ животным в возрасте 10 мес не оказывало влияния на ПБЧ, а в возрасте 18 мес субсудорожная доза ПТЗ вызывала проноцицептивное действие в течение всего периода наблюдения (6 дней). В тесте tail flick мы наблюдали противоположный эффект: субсудорожная доза вызывала антиноцицептивное действие также в течение всего периода наблюдения.
Введение судорожной дозы ПТЗ как в тесте hot plate, так и в тесте tail flick вызывало антиноцицептивное действие у животных всех возрастных групп. В тесте tail flick значение ПБЧ через 30 мин после введения судорожной дозы в возрасте 10 и 18 мес было выше по сравнению с 3-месячными, а в тесте hot plate наиболее высокое значение ПБЧ наблюдалось в возрасте 3 мес через 30 мин после введения судорожной дозы ПТЗ. В возрасте 10 и 18 мес значения ПБЧ хотя и были выше исходных показателей, но ниже, чем у 3-месячных животных (рис. 2). В какой-то степени это можно объяснить эффектом увеличения количества повторных тестирований при проведении исследований. Так, в возрасте 3 мес выпрыгивало 6,6% животных, а в возрасте 10 и 18 мес — 55,55% животных (p=0,025).
Таким образом, при сравнении результатов этих двух тестов в нашем исследовании было установлено, что одни и те же возрастные группы животных могут демонстрировать вариации в зависимости от типа используемого теста. Неоднозначность эффектов, возможно, обусловлена большей сложностью теста hot plate, в котором ответы животных представляют собой поведенческие реакции, формирующиеся в результате тесного взаимодействия спинальных и супраспинальных механизмов, они используются для определения особенностей регуляции болевой чувствительности на уровне центральных структур мозга [10, 11].
Заключение
ПТЗ в субсудорожных дозах (10—20 мг/кг) способен вызывать развитие состояния тревожного беспокойства и страха у людей и изменение поведения у животных по типу тревоги и страха [12, 13]. Следовательно, проноцицептивный эффект после введения ПТЗ в субсудорожной дозе у животных в возрасте 3 и 18 мес в тесте hot plate может быть связан с повышением уровня тревожности [13, 14]. В тесте tail flick у 18-месячных животных субсудорожная доза ПТЗ вызывала антиноцицептивное действие в течение всего периода наблюдения (6 дней). По-видимому, выявленные различия в восприятии боли зависят от применяемого болевого теста. С другой стороны, в возрасте 10 мес введение субсудорожной дозы ПТЗ не влияло на ПБЧ как в тесте hot plate, так и в тесте tail flick, что может быть обусловлено возрастзависимым снижением чувствительности животных к действию ПТЗ, которое наблюдали в своих исследованиях A. Hoeller и соавт. (2017) у зрелых животных в возрасте 12 мес [15].
Введение ПТЗ в дозе, вызывающей судороги тяжестью 4—5 баллов, оказывало антиноцицептивное действие независимо от возраста животных и применяемого теста. Известно, что эндогенные системы подавления боли могут быть активированы судорогами [16]. При этом после припадка задействуется как эндогенная опиоидная система, так и другие антиноцицептивные механизмы [17—19]. Однако эффекты постприступной антиноцицепции обычно наблюдаются непродолжительный период времени — от 30 до 120 мин [16, 19]. В нашем исследовании в тесте hot plate у 3 и 10-месячных животных антиноцицептивный эффект наблюдался в течение 6 дней, а у стареющих 18-месячных крыс антиноцицептивное действие наблюдалось только в течение 30 мин после введения судорожной дозы ПТЗ. Противоположной была картина в тесте tail flick: у 3-месячных и 10-месячных животных антиноцицептивный эффект наблюдался короткое время и только через 24 ч и 30 мин соответственно, а у стареющих, 18-месячных животных антиноцицептивный эффект сохранялся в течение всего периода наблюдения.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.