Восстановление целостности периферических нервов при протяженном диастазе является сложной клинической задачей. Достижения в микрохирургических методах, экспериментальные исследования с использованием моделей in vitro и in vivo, более глубокое понимание патофизиологии повреждения нервов улучшили функциональные результаты [1]. Однако восстановление анатомо-физиологической целостности поврежденного периферического нерва представляет собой не до конца решенную проблему [2].

При непротяженном дефекте нерва его анатомическую целостность восстанавливают путем наложения хирургических швов по типу конец в конец [3]. Для регенерации нерва при диастазе 10 мм и более применяются кондуиты. Стимуляция и/или регуляция регенерации нервных волокон, заключенных в кондуит, является ключевым фактором для последующей нейрорегенерации. Некоторые биоматериалы кондуитов, например полипиррол и полианилин, способны повысить рост нейритов в сочетании с низкоинтенсивной электрической стимуляцией, в то время как другие материалы не оказывают стимулирующего действия на регенерацию аксонов [4—8]. Увеличение регенеративного потенциала внутренней среды кондуитов достигается использованием клеточных (стволовые клетки, шванновские клетки) и/или гуморальных факторов (факторы роста), которые оказывают в разной степени стимулирующее влияние на рост аксонов [8].

ЦСЖ играет ключевую роль в обеспечении физиологических функций нейронов мозга [9]. В частности, в органотипических срезах мозга человека ЦСЖ повышает выживаемость нейронов, улучшает работу нейронных сетей и функциональную активность клеток в течение нескольких недель [10]. Функциональный потенциал ЦСЖ обусловлен большим количеством соединений, начиная от ионов, белков, липопротеинов и метаболических продуктов до нейропептидов и гормонов [11].

Развитие клеточных структур коры больших полушарий головного мозга зависит от активной интеграции автономных и внешних сигналов, но координация этих процессов плохо изучена. Тем не менее известно, что апикальные комплексные белки Pals1 и Pten выполняют противоположные функции в локализации инсулиноподобного фактора роста 1 (Igf1) в апикальном, вентральном доменах прогениторных клеток коры головного мозга. В частности, ЦСЖ, которая контактирует с апикальным доменом, оказывает возрастзависимое действие на пролиферацию клеток, большая часть которой приписывается инсулиноподобному фактору роста 2 (Igf2). ЦСЖ содержит также другие сигнальные факторы. Так, образцы ЦСЖ у пациентов с мультиформной глиобластомой показывают повышенный Igf2 и стимулируют пролиферацию стволовых клеток в Igf2-зависимом режиме. Предполагается, что апикальный комплекс объединяет внутреннюю и внешнюю сигнализацию, позволяя прогениторам воспринимать и соответствующим образом реагировать на сигналы, передаваемые через ЦСЖ и широко распространенные по всему мозгу. Физиологические механизмы регуляции состава ЦСЖ имеют критическое значение для развития патологических состояний.

В частности, белок Pals1 необходим для поддержания мозжечковых прогениторных клеток в пролиферативном состоянии, миграции нейронов, аксонного детерминирования, дендритного развития, тканевой полярности и выживания нейронов [12].

Относительно недавно было показано, что ЦСЖ регулирует развитие и поведение нервных стволовых клеток в головном мозге. Одним из компонентов такой регуляции является Igf2, который стимулирует в мозге деление стволовых клеток [11]. Пик концентрации Igf2 в ЦСЖ возникает в период, когда в коре наиболее интенсивно формируются нейроны, а после рождения и до периода полового созревания у взрослого человека этот процесс менее выражен. Вместе с тем мозг имеет собственные возможности для формирования подобных сигналов. Так, рецепторы Igf1 на стволовых клетках мозга взаимодействуют с апикальными протеинами таким образом, что эта часть нейронов осуществляет прямой контакт с ЦСЖ. Более того, формирует своеобразные пальцевидные вдавления, которые увеличивают функциональные возможности подобного нейрон-ЦСЖ-взаимодействия.

Если ткань развивающегося мозга омывать ЦСЖ взрослого животного и, напротив, омывать ткань взрослого мозга ЦСЖ молодого животного, то нейрональные прогениторные стволовые клетки по-разному реагируют на то, в какой ЦСЖ они находятся. Это указывает на важную роль, которую выполняют белки ЦСЖ в глобальном регулировании нейрогенеза в головном мозге.

ЦСЖ, по данным исследователей [13], способствует развитию и распространению нейроэктодермальных стволовых клеток. У эмбриона ЦСЖ повышает выживаемость этих клеток во время их пролиферации и дифференцировки, а также стимулирует глиогенез [14]. Таким образом, ЦСЖ принадлежит важная роль в процессах развития нейронных и глиальных структур головного мозга. Несмотря на то что регенеративные функции ЦСЖ остаются недостаточно изученными, аутентичную ЦСЖ стали использовать в качестве внутренней среды кондуита [15]. Роль аутентичной ЦСЖ в процессах восстановления нерва после его повреждения проанализирована наиболее подробно.

В экспериментах на поврежденных периферических нервах крысы кондуиты, выполненные из коллагена, заполняли физиологическим раствором или ЦСЖ, а в контрольной серии опытов выполняли нейрорафию (конец в конец) и использовали аутотрансплантат нерва. Объем аутентичной ЦСЖ предварительно центрифугировали в течение 10 мин и хранили при –80 °C до введения в коллагеновые кондуиты [16, 17]. До операции, а затем на 7, 21, 35, 49, 60, 90-й дни после операции исследовали особенности восстановления двигательной функции во время движения. Исследователями было показано, что средние значения функционального индекса седалищного нерва составили –41,64±3,73 и –38,04±5,11 в серии опытов «коллаген—ЦСЖ» и –59,89±4,78 и –49,45±6,21 в серии опытов с аутотрансплантатом. Это указывает на то, что предложенная технология приближена по результатам восстановления двигательных функций пораженной конечности к «золотому стандарту» репарации нервов при протяженных диастазах. Кроме того, крысы групп «коллаген—ЦСЖ» и «аутотрансплантат» статистически отличались от контрольной группы тем, что не было особых различий между значениями функционального индекса «коллаген—ЦСЖ» и «аутотрансплантат» в течение 90 дней после операции. На 90-й день скорость проведения по нерву составляла для групп «коллаген—ЦСЖ» и «аутотрансплантат» 39,7±3,53 и 30,05±4,71 м/с соответственно. Значимые данные были получены в результате гистологического и иммуногистохимического исследований материала области регенерации нервов. Так, в препаратах из серии опытов «коллаген—ЦСЖ» нервные стволы содержали пучки аксонов, волокна были расположены по центру в кондуите и окружены эпиневрием, состоящим из нескольких слоев расположенных по окружности фибробластов и слоев коллагеновых волокон. Кровеносные сосуды были выявлены по ходу всего участка регенерации нерва. Слой макрофагов был выявлен на внешней поверхности направляющего канала коллагена. На 90-й день после начала исследования число миелиновых аксонов было значительно больше в серии «коллаген—ЦСЖ» (5621±919) по сравнению с серией «коллаген—физиологический раствор» (3437±908). Более выраженная экспрессия белка S-100 выявлена в миелине серии опытов «коллаген—ЦСЖ», чем «аутотрансплантат» [15]. Таким образом, аутентичная ЦСЖ в качестве внутренней среды кондуита оказывает стимулирующее действие на процессы регенерации периферического нерва in vivo.

Стволовые клетки и нейротрофические факторы также применяются исследователями в качестве факторов стимуляции регенерации аксонов в поврежденных периферических нервах. В частности, к таковым относят технологии контроля процессов высвобождения/доставки нейротрофических факторов, стволовых клеток и леммоцитов, белков внеклеточного матрикса и др. [18].

Нервные стволовые клетки могут обеспечить восстановление утраченных нейронов, увеличить число глиальных опорных клеток в мозге, а также участвовать в создании микроокружения вокруг участка повреждения нерва. Технологии применения стволовых клеток привлекают особое внимание как перспективное направление в регенеративной медицине [19].

Нейрональные стволовые клетки генерируют новые нейроны, которые интегрируются в уже существующие нейронные сети в конкретных участках мозга позвоночных, а также имеют нейрорегенеративный потенциал у некоторых немлекопитающих позвоночных, например у рыб. Так, после травмы регенерация нейронов увеличивается как путем активации нейрональных стволовых клеток, так и сменой режима их деления [20].

В частности, к успешным следует отнести современные технологии перепрограммирования соматических клеток (например, фибробласты кожи) в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) [21]. Благодаря способности ИПСК к неограниченному росту получила развитие такая область медицины, как клеточная трансплантология (клеточная терапия). Прогресс в изучении этих свойств позволил воссоздавать мультипотентные стволовые клетки, например клетки нервного гребня, которые в свою очередь могут дифференцироваться в шванновские клетки. Дальнейшее изучение свойств ИПСК может привести к превосходному терапевтическому эффекту и продемонстрировать новые возможности для регенеративной медицины и тканевой инженерии [22].

Нейрональные стволовые клетки могут дифференцироваться в нейроны или глиальные клетки, они участвуют во время нейрогенеза в развитии головного и спинного мозга, а также способны стимулировать нейрорегенерацию [23]. Стволовые клетки секретируют нейротрофические факторы, которые стимулируют нейрогенез и пролиферацию шванновских клеток при восстановлении поврежденных периферических нервов [24]. Однако применение нейрональных стволовых клеток имеет риски. Например, применение клеток C17.2 у мышей продемонстрировало высокую скорость образования нейробластомы [25]. Несмотря на это, стволовые клетки применяют в экспериментах по восстановлению целостности периферических нервов. Стволовые клетки могут быть доставлены в зону травмы для восполнения регенеративных свойств методом суспендирования в среде, которая в дальнейшем инъецируется в окончание нерва в пределах диастаза [26]. Процесс микроинъекции может быть травматичен как для стволовых клеток, так и для структуры нерва. Используется также метод суспендирования стволовых клеток в матрицу фибрина и ее дальнейшее размещение вокруг травмированного участка нерва [27, 28]. При использовании кондуита стволовые клетки вводят в его полость или в ту матрицу, которая заполняет пространство кондуита.

Физиологическая роль шванновских клеток после травмы нерва проявляется в процессах стимуляции регенерации нервных волокон: ядра леммоцитов усиленно делятся и мигрируют по ходу роста аксонов. В результате перепрограммирования, т. е. адаптационного посттравматического механизма [19], они утрачивают типичное строение и, располагаясь лентовидно, принимают форму полосок Бюнгера [29]. В дальнейшем высвобождаются факторы роста, хемоаттрактанты и поверхностные белки, такие как мозговой нейротрофический фактор (BDNF), артемин, NT-3, NGF, VEGF, эритропоэтин, плейотрофин, p75NTR, N-кадгерин и другие биологически активные вещества [30], которые способствуют направленному росту аксонов, а также нейропротекции. Некоторые из них представляют группу нейротрофинов, например BDNF и нейротрофические факторы — NT-3, NT-4/5 и NT-6.

Регенеративная роль шванновских клеток в кондуите может заключаться в создании вектора направления регенерации нервных волокон. Например, известно, что кровеносные сосуды обусловливают направленность движения шванновских клеток. Этот феномен наглядно продемонстрирован на крысах методом интраоперационного иммуноокрашивания пересеченного седалищного нерва. С помощью перенаправления кровеносных сосудов исследователи смогли направить миграцию леммоцитов из нерва в окружающие ткани. По-видимому, увеличить эффективность и точность роста нервных волокон можно за счет сохранения микрососудистого русла нерва в структуре кондуита [31]. Шванновские клетки имеют значительный потенциал пластичности: способны перепрограммироваться после повреждения нервов, что приводит к стимуляции процессов восстановления нервной ткани и регуляции миелинизации [19, 32].

Нейротрофические факторы нашли применение в качестве компонентов внутренней среды кондуитов для стимуляции регенеративных процессов в нервных волокнах после их повреждения. В настоящее время открыто множество нейротрофических факторов: фактор роста нервов (NGF), BDNF, глиальный нейротрофический фактор (GDNF), нейротрофин-3 (NT-3), нейротрофин-4/5 (NT-4/5), фактор роста фибробластов (aFGF, bFGF), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF-1), фактор роста тромбоцитов (PDGF) [33]. Так, NGF является первым идентифицированным нейротрофическим фактором. Результаты исследований показали, что использование NGF после травмы периферических нервов способствует лучшей регенерации нервной ткани. В частности, улучшаются показатели аксональной регенерации седалищного нерва крысы. Особенность технологии доставки NGF заключалась в том, что использовали гепарин для иммобилизации NGF и замедления его диффузии из матрицы фибрина. Исследователи протестировали влияние контролируемой доставки NGF на регенерацию периферического нерва при дефекте седалищного нерва длинной 13 мм. Гепаринсодержащую систему доставки изучали в сочетании с тремя дозами NGF (5, 20 или 50 нг/мл). Результаты сравнивали с «положительными» контрольными группами (аутотрансплантат) и «отрицательными» (только фибрин, только NGF и пустые каналы). В результате выявлено, что общее количество нервных волокон как в проксимальном отделе нерва, так и в дистальном не имело статистической разницы для доз NGF при 20 и 50 нг/мл от аутотрансплантата. Таким образом, система доставки NGF, обеспечивающая контролируемое высвобождение факторов роста, усиливает регенерацию поврежденного периферического нерва и представляется достаточно успешной для усиления регенерации нервов через короткий посттравматический промежуток времени [34].

Другим нейротрофическим фактором, положительно влияющим на регенерацию нервов, является BDNF. Доказаны его нейропротективные свойства, способность предотвращать гибель моторных нейронов коры головного мозга у новорожденных крыс. Кроме того, у BDNF выявлен положительный регенеративный эффект после повреждения нерва полового члена, седалищного нерва и зрительного нерва. Эффект BDNF связан с его дозозависимым действием. Так, BDNF в высокой концентрации (12±20 мг/сут в течение 28 дней) взаимодействует с рецепторами р75, которые являются ингибиторами регенерации аксонов [35].

Нейропротективные свойства имеет GDNF, который предотвращает атрофию, например аксонов лицевого нерва, и, как полагают, является мощным защитным фактором против индуцированной моторной и сенсорной гибели нейронов [36]. Применение GDNF увеличивает количество аксонов моторных нейронов, иннервирующих нервно-мышечные синапсы in vivo [37].

Роль NT-3 и NT-4/5 как стимуляторов регенерации поврежденных моторных нейронов полностью не изучена. Однако имеющиеся данные свидетельствуют о том, что NT-3 и NT-4/5 могут быть столь же эффективны, как BDNF. Показано, что NT-3 способствует выживанию стволовых клеток костного мозга и нейрональной дифференцировке. Стволовые клетки костного мозга, совместно культивированные на полимолочнокислой согликолевой кислоте с NT-3 или с фармакологически активными микроносителями, выделяющими NT-3, имеют значительно больший процент выживания и дифференциации нейронов [38].

Создание скаффолдсодержащих внутренних сред для кондуитов является достаточно трудной задачей и имеет множество технологических вариаций. Показано, что перспективно использование полипиррола для синтеза микросфер. Для этого полипирроловые наночастицы, имеющие сферическую форму, подвергают химической полимеризации. В дальнейшем вещество растворяют в 230 мл деионизированной воды при 40 °C в течение 3 ч и затем охлаждают до комнатной температуры. До применения пирроловые скаффолды хранят при температуре 4 °C [39].

Считается, что очень важно создать тесный контакт между содержимым скаффолда и его стенкой. Шванновские клетки и мезенхимальные стволовые клетки пуповины человека наиболее активно проявляли способность к адгезии, что указывало на отличную совместимость их структур с каркасом. Было выдвинуто предположение, что, придав пористую структуру и шероховатость нановолокнам, из которых состоит скаффолд, можно еще больше усилить адгезию клеток.

Часто применяемой технологией для стимуляции нейрорегенеративных процессов в травмированных нервах является использование нейротрофических факторов в виде микронаполнителей скаффолдов. Так, M. Xing и соавт. помещали BDNF-фактор в желатиновые микросферы, заполненные желатин-метакриламидным гидрогелем. В дальнейшем этот конгломерат внедряли в двухслойный кондуит из коллагена. Средний диаметр микросфер, заполненных BDNF, составлял 3,91±1,87 мкм. В результате были выявлены упорядоченные структуры в нервной ткани: расположение нервных волокон оказалось более компактным и частым по сравнению с применением только коллагенового кондуита. Оказалось, что площадь поперечного сечения регенерирующего нерва была наибольшей при использовании аутотрансплантата и коллагеновой трубки с BDNF-микросферами. Также обнаружено вокруг нервных волокон множество новых кровеносных сосудов и соединительной ткани [40]. Положительный эффект продемонстрирован со скаффолдсодержащей средой кондуита с NGF в случае использования поли-ε-капролактоновых микросфер [41]. Причем не только нейротрофические факторы применяются как микронаполнители. В другом исследовании авторы использовали в качестве основного материала биоактивную трехмерную свиную бесклеточную дермальную матрицу, которая в основном состояла из коллагена I типа. Кроме того, был успешно смоделирован слой восстановленных нанокристаллов графенового оксида на поверхности скаффолдов для получения пористого трехмерного биоразлагаемого проводящего и биосовместимого каркаса для нервной ткани. Результаты продемонстрировали способность скаффолдсодержащей среды к дифференцировке мезенхимальных стволовых клеток в нейроны с более высокими уровнями экспрессии белка через 7 дней [42].

В дополнение к технологиям имитации структуры нативного нерва в конструкции кондуитов [43] и биомолекулярных компонентов изучается применение проводящих полимеров и электростимуляции как относительно нового подхода к активации развития нейритов и регенерации аксонов.

Клеточные мембраны проводят электрический потенциал, что стимулирует рост нервов к периферии [44]. Понимание этого привело к применению проводящих биоматериалов, таких как полипиррол и полианилин, которые способны усилить распространение поля нейритов при неинтенсивной электрической стимуляции.

Показано, что выровненное нановолокно полилактид-ко-гликозида, покрытое полипирролом, эффективнее поддерживает рост и дифференциацию клеток PC12 крысы и нейронов гиппокампа по сравнению с непокрытыми направляющими сетками. Клетки PC12, стимулированные потенциалом 10 мВ/см на скаффолдах «полипиррол-полилактид-ко-гликозид», имели на 40—50% более длинные нейриты и на 40—90% большее количество образованных нейритов по сравнению с нестимулированными клетками на тех же самых скаффолдах [45]. Зона репарации нейритов увеличивалась, когда модели фоторезисторов были легированы электропроводящими полимерами, полипирролом, а также конъюгированными NGF и поли-L-лизин/ламинином [46, 47].

Нервные стволовые клетки, культивированные на смешанных скаффолдах полипиррол/полианилин (в соотношении 85:15), демонстрировали распространяющийся рост нейритов через 60 мин электростимуляции in vitro с использованием электрического поля 100 мВ/мм. Этого процесса не наблюдали у клеток, культивируемых на нестимулированных скаффолдах.

Таким образом, исследования показали, что нейрональная дифференциация клетки PC12 зависима от способности субстратов к проведению электрического импульса [48].

В обзоре обобщены современные методы восстановления и регенерации повреждений периферических нервов с учетом состава внутренней среды кондуитов. Применение аутентичной ЦСЖ в качестве внутренней среды кондуитов не несет в себе риска отторжения и каких-либо побочных эффектов. Кроме того, ЦСЖ содержит в своем составе вещества, наличие которых активирует регенерацию периферического нерва после его повреждения.

Трансплантация стволовых клеток демонстрирует некоторое улучшение результатов восстановления диастаза нервов после повреждения, но по-прежнему эта технология уступает регенеративному потенциалу других методов нейрорегенерации [49].

Более известны положительные эффекты применения для регенерации поврежденных нервов шванновских клеток и нейротрофических факторов. При этом все приведенные в настоящем обзоре внутренние среды кондуитов относятся к технологиям выбора. Считается, что наиболее перспективным является применение комплекса стимулирующих регенерацию нерва факторов во внутренней среде кондуитов, так как за счет этого можно совместить все положительные свойства компонентов внутренней среды и получить наилучшие результаты в технологиях нейрорегенерации периферических нервов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Пятин Василий Федорович — д.м.н., проф., заведующий кафедрой физиологии ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России, Самара, Россия; e-mail: pyatin_vf@list.ru; https://orcid.org/0000-0001-8777-3097

Тутуров Александр Олегович — студент ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России, Самара, Россия; e-mail: atneuro@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0003-4136-644X

*e-mail: yakovi-aleksandr@yandex.ru;
https://orcid.org/0000-0003-4136-644X