Вовлеченность процессов воспаления в патогенез психических заболеваний была установлена в ряде клинических и экспериментальных исследований [1—3]. Ранее нами [4—6] были выявлены качественные и количественные особенности спектра воспалительных маркеров (иммунофенотипы), характеризующие различные стадии психического заболевания, например развитие психоза или ремиссии [4], а также определенные симптомокомплексы, например астенический. Дальнейшее изучение иммунофенотипов может оказаться чрезвычайно полезным как для диагностических целей, так и повышения эффективности терапии пациентов иммунотропными препаратами. Особый интерес в отношении выявления определенных иммунофенотипов представляют непсихотические психические расстройства, включая расстройства адаптации, обусловленные различными психогенными факторами [7, 8]. Известно, что их клинические проявления вариабельны, но в целом они характеризуются превалированием тревожной, депрессивной и астенической симптоматики. Ранее нами было показано, что пациентов с расстройствами адаптации характеризуют различные иммунофенотипы, которые оказались несвязанными с особенностями клинической симптоматики, что в свою очередь может быть обусловлено недостаточной структурированностью ведущего психопатологического синдрома и определенными трудностями дифференциальной диагностики.

Цель настоящего исследования — выявление иммунофенотипов пациентов с расстройствами адаптации при помощи кластерного анализа с использованием в качестве классифицирующих признаков уровня таких функционально-связанных воспалительных маркеров, как энзиматическая активность лейкоцитарной эластазы (ЛЭ) и функциональная — α1 протеиназного ингибитора (α1-ПИ).

В обследование были включены 40 пациентов с расстройствами адаптации, из них 35 женщин, поступивших на лечение в клиники НИИ психического здоровья Томского национального исследовательского медицинского центра (дир. — акад. РАН Н.А. Бохан).

Диагностическая оценка и клиническая квалификация пациентов осуществлялись в соответствии с МКБ-10. «Расстройства адаптации» по этой классификации входят в рубрику F43.2, составляя часть класса «Невротические, связанные со стрессом и соматоформные расстройства» (F4). Речь идет о состояниях субъективного дистресса и эмоционального расстройства, препятствующих социальному функционированию.

Исследование с участием людей проведено с соблюдением принципов информированного согласия Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации и одобрено локальным Этическим комитетом при НИИ психического здоровья Томского национального исследовательского медицинского центра (протокол № 53 от 01.10.12).

Контрольную группу составили 23 здоровых человека, сопоставимых по возрасту и полу с пациентами.

Забор крови для биологических исследований осуществляли из локтевой вены утром натощак с использованием стерильной системы однократного применения Vacutainer («Becton Dickinson», США) в пробирки с активатором свертывания крови. Пробирки с кровью центрифугировали при комнатной температуре при 1500—2000 об/мин 15—20 мин; сыворотку отбирали, разливали по 0,3—0,5 мл в пробирки для микропроб типа эппендорф и хранили в низкотемпературной камере при –70—80 °С до использования.

Определение активности маркеров воспаления — энзиматической активности ЛЭ и функциональной активности α1-ПИ проводилось в Лаборатории нейроиммунологии (руководитель — проф. Т.П. Клюшник) Научного центра психического здоровья.

Энзиматический метод определения активности ЛЭ. Эластазную активность сыворотки крови, обусловленную на 90% присутствием в сыворотке комплекса ЛЭ с α1-ПИ, определяли ферментативным методом, предложенным В.Л. Доценко и соавт. [9]. Активность Л.Э. измеряли по скорости расщепления эластазой специфического хромогенного субстрата N-терт-бутоксикарбонил-L-алaнин-паранитрофенилового эфира (BOC-Ala-ONp) фирмы «ICN Biomedical Inc.» в условиях, подобранных для полного высвобождения фермента из комплекса ЛЭ — α1-ПИ, при 25 °C. Регистрировали изменение оптической плотности с помощью компьютерной программы SWIFT 1000 Reaction Kinetics (Version 2.03, «Biochrom Ltd») на спектрофотометре Ultrospec 1100 («Amercham») в течение 3 мин при длине волны 347 нм, соответствующей максимуму поглощения продукта реакции. Активность Л.Э. выражали в нмоль/мин·мл. Чувствительность метода 40 нмоль/мин·мл, коэффициент вариации результатов определения активности ЛЭ в одном и том же образце (10 повторений) не превышает 8%.

Метод определения активности α1-ПИ. Измерение активности α1-ПИ в сыворотке крови проводили с помощью спектрофотометрического метода [10]. Метод основан на взаимодействии этого ингибитора с трипсином при использовании в качестве субстрата N-α-бензоил-L-аргининэтилового эфира гидрохлорида (BAEE) «ICN Biomedical Inc.»: α1-ПИ образует с трипсином комплекс, не гидролизующий BAEE. Активность α1-ПИ в сыворотке определяли по степени торможения BAEE-эстеразной активности трипсина определенным количеством исследуемой сыворотки. Регистрировали изменение оптической плотности с помощью компьютерной программы SWIFT 1000 Reaction Kinetics (Version 2.03, «Biochrom Ltd») на спектрофотометре Ultrospec 1100 («Amercham») в течение 3 мин при длине волны 253 нм. Активность α1-ПИ выражали в ингибиторных единицах на мл (ИЕ/мл). Чувствительность метода 5 ИЕ/мл, коэффициент вариации результатов определения функциональной активности α1-ПИ в одном и том же образце не превышает 5%.

Статистическая обработка базы данных осуществлялась в лаборатории доказательной медицины и биостатистики (руководитель — канд. биол. наук А.Н. Симонов) Научного центра психического здоровья.

Кластерный анализ представляет собой общее название множества математических методов, направленных на формирование отдаленных друг от друга групп относительно близких между собой объектов по данным о расстояниях или связях (меры близости) между ними в ситуации, когда отсутствует априорная информация относительно принадлежности объектов к группам.

К настоящему времени известно несколько сотен различных алгоритмов кластеризации [11—14] многомерных данных, однако общей теории оценки адекватности кластерного решения не существует [15]. Наиболее оптимальным путем оценки устойчивого кластерного решения является использование нескольких алгоритмов кластеризации на одних и тех же данных [16]. Если различные алгоритмы кластеризации приводят к близким результатам, то вероятнее всего, что полученное решение соответствует реальной кластерной структуре в изучаемом наборе данных.

В предлагаемой работе использовали следующие алгоритмы кластеризации: а) иерархический агломеративный метод, результаты которого оформлены в виде дендрограммы; б) итеративный алгоритм k-средних и метод расщепления смеси вероятностных распределений (ЕМ-алгоритм). Далее проводили оценку качества полученного кластерного решения при помощи набора индексов.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программ R (R version 3.2.4) и STATA (version 12.1).

Средняя энзиматическая активность ЛЭ в группе пациентов с расстройствами адаптации составила 245,1± 33,4, функциональная активность α1-ПИ — 41,6±7,0 (среднее±стандартное отклонение). Оба эти показателя достоверно (p<0,001 и p<0,0001 соответственно) превышали соответствующие значения контрольной группы — 219,1±15,2 и 33,1±5,9 соответственно, что свидетельствует о вовлеченности воспаления в патофизиологию расстройств адаптации.

Вместе с тем отмечался значительный разброс показателей активности ЛЭ (от 172,2 до 310,0 нмоль/мин·мл) в группе пациентов: наблюдались значения, выходящие за пределы контрольного диапазона в сторону как повышения, так и понижения этого показателя. Отметим, что активность α1-ПИ во всех случаях превышала контрольные значения.

Такой широкий разброс экспериментальных данных послужил основанием для проведения кластерного анализа.

На рис. 1 представлена

Пунктирная линия на рис. 1 обрезает дендрограмму на уровне максимального разделения кластеров, выделяя три отчетливых кластера из 20, 12 и 8 объектов. Аналогичный результат был получен при построении дендрограммы по методу полной связи. В табл. 1 приведены

Итерационный метод k-средних. Это наиболее популярный метод кластеризации, основанный на минимизации суммарного квадратичного отклонения точек кластеров от их центров. При этом количество кластеров неизвестно и его необходимо задать.

Оценить оптимальное количество кластеров можно по зависимости суммарного квадратичного отклонения от количества кластеров. Если построить зависимость суммарного квадратичного отклонения от количества кластеров, истинное значение количества кластеров можно оценить по точке перегиба на таком графике (рис. 2).

Основные характеристики кластеров, полученных по методу k-средних, приведены в табл. 2.

На рис. 3 представлено

Индексная оценка качества кластеризации. Оценка качества кластерного решения (валидация) является важнейшим этапом кластерного анализа. В статистическом пакете R имеется несколько десятков различных методов (индексы) оценки количества кластеров в изучаемом наборе данных. На рис. 4 представлено

Математически близкий подход кластеризации по методу k-средних — метод разделения смеси распределений. Предполагается, что имеющиеся данные являются случайной выборкой из смеси вероятностных распределений с известной или неизвестной функцией распределения. Если предположить, что данные являются смесью гауссовых распределений, то такую смесь можно разделить на отдельные компоненты (кластеры) при помощи ЕМ-алгоритма. На рис. 5 и 6

Таким образом, в результате использования нескольких алгоритмов кластерного анализа экспериментальных данных получены устойчивые решения из трех кластеров для анализируемых воспалительных маркеров. Такой результат позволяет выдвинуть гипотезу о существовании в группе обследованных пациентов с расстройствами адаптации трех иммунофенотипов. Отметим, что выявленные иммунофенотипы характеризуются различными соотношениями активности ЛЭ и α1-ПИ, и эта вариативность определяется прежде всего различной активностью ЛЭ. α1-ПИ относится к острофазным белкам, синтезирующимся в печени, индуктором повышенного синтеза которого в ходе развития воспалительного ответа является провоспалительный интерлейкин ИЛ-6. Функциональная роль α1-ПИ заключается в ингибировании активности протеаз, в первую очередь лейкоцитарной эластазы, что ограничивает ее деструктивный потенциал. Повышение активности ЛЭ в крови в ходе развития воспалительного ответа является результатом дегрануляции активированных нейтрофилов — главнейшего клеточного компонента врожденного иммунитета. Имеются также данные о том, что при воспалении активированные нейтрофилы участвуют в механизмах адаптивных иммунных реакций, модулируя иммунный ответ не только на экзо-, но и эндогенные стимулы, к числу которых относятся и продукты нейродегенерации, комплексы антиген—антитело и др. [17—20].

Сказанное свидетельствует о том, что в ходе развития иммунного ответа на тот или иной патологический стимул повышается уровень как острофазных белков и других медиаторных молекул, так и секреторных белков нейтрофилов, к которым относится Л.Э. Важнейшая роль ЛЭ заключается не только в увеличении проницаемости сосудов (в случае заболеваний мозга — это сосуды гематоэнцефалического барьера), но и в контроле функций различных клеток, вовлекаемых в процессы свертывания крови, воспаления, репарации тканей и синтеза специфических антител [21, 22]. Ранее проведенные исследования показали, что активность ЛЭ может служить маркером остроты и тяжести эндогенного патологического процесса в мозге [23].

Таким образом, в настоящем исследовании было выявлено три устойчивых кластера в рамках расстройств адаптации, отражающих различные соотношения анализируемых иммунных маркеров. Особое внимание, на наш взгляд, заслуживает кластер 1, характеризующийся относительно низкими показателями активности ЛЭ на фоне высокой активности α1-ПИ, что, вероятно, является отражением нарушения связи между различными звеньями цепочки иммунного ответа. Такое соотношение исследуемых воспалительных маркеров может отражать функциональную недостаточность нейтрофилов, следствием которой может являться неспособность сформировать адекватный функциональный ответ на протекающий патологический процесс.

Для проверки высказанных предположений целесообразно сопоставить выделенные кластерные иммунофенотипы с особенностями клинической симптоматики пациентов, а также оценить влияние используемой терапии, в том числе иммунотропной, на динамику не только клинических, но и иммунологических показателей. Это позволит выявить иммунологические предикторы эффективности тех или иных терапевтических мероприятий, а также разработать дополнительные диагностические критерии на основе индивидуальных иммунологических показателей пациентов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: klushnik2004@mail.ru