Матриксные металлопротеиназы (ММП) относятся к семейству внеклеточных цинк- и кальцийзависимых эндопептидаз, вовлекающих внеклеточный матрикс в процессы ремоделирования — деградацию или протеолиз коллагеновых волокон и других компонентов внеклеточного матрикса [1—3]. Синтез ММП регулируется на разных уровнях, включая транскрипцию, активацию белка и взаимодействие с эндогенными ингибиторами. Все ММП обладают относительной субстратной специфичностью. Представители подсемейства ММП-2 и ММП-9 отвечают за деградацию компонентов соединительнотканного матрикса сосудистой стенки (коллаген IV, V типов, эластин, фибронектин, ламинин) [3, 4]. Большинство ММП относятся к индуцируемым ферментам, которые в обычных условиях содержатся в тканях в незначительных количествах. Исключение составляет ММП-2, которая, по-видимому, является единственным представителем конститутивной формы этой группы ферментов. ММП модулируют деградацию компонентов внеклеточного матрикса, связываясь со специфическими рецепторами, экспрессия которых усиливается при увеличении концентрации в тканях ряда провоспалительных цитокинов, нейропептидов, интегринов, факторов роста и т. д. [3—6].

Регуляция активности ферментов на посттрансляционном уровне осуществляется при взаимодействии с тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (ТИМП). При этом ТИМП-2 в значительной степени подавляет в тканях активность ММП-2, а ТИМП-1 — ММП-9 [7, 8]. Баланс между концентрацией ММП и их ТИМП обеспечивает оптимальный уровень обмена в тканях, а нарушение этого равновесия приводит к деградации компонентов внеклеточного матрикса и развитию патологии [7—9].

Цель исследования — изучить локализацию ММП-2 и -9 и их тканевых ингибиторов в пиальных, внутримозговых артериях и капиллярах крыс при длительном воздействии табачного дыма.

Работа выполнена на 18 крысах-самцах линии Вистар массой 220—240 г, произвольно выделенных в 2 группы, которых исследовали в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977). У 10 крыс, составивших 1-ю группу, формировали модель хронического табакокурения путем дозированной подачи табачного дыма в специализированную камеру (по одной пачке сигарет ежедневно) [10]. Крысы подвергались воздействию табачного дыма в течение 36 нед, что соотносится с показателями безусловного курильщика [11]. Во 2-ю (контрольную) группу включили 8 крыс, на которых не оказывалось воздействие табачного дыма.

Все животные содержались на стандартном рационе в одинаковых условиях лабораторного вивария. Крыс анестезировали внутрибрюшинным введением рометара (ксилазин, «Spora», Чехия) в концентрации 5,5 мг/кг, а затем декапитировали. Головной мозг извлекали из полости черепа вместе с сосудами мягкой оболочки. Образцы фиксировали при 4 °C в течение 4 ч в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на 0,1 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,4), заливали в парафин по общепринятой методике, готовили серийные срезы и проводили их иммуногистохимическое исследование. Для этих целей использовали первичные антитела анти-MMП-2 и -9 (rabbit polyclonal, «Thermo Scientific», rb-9234-p, 1:200), анти-TИMП-1 и -2 (rabbit polyclonal, «Abcam», ab61224, 1:100), биотинилированные вторичные антитела («Thermo Scientific»), комплекс стрептавидин—пероксидаза («Thermo Scientific») и хромоген (peroxidase substrate kit, «Vector NovaRED», SK-4800). Инкубация с первичными антителами осуществлялась при температуре 4 °C, обработка вторичными антителами и хромогеном выполнялась в соответствии с рекомендациями фирм-производителей. Для анализа изменений тканей некоторые параллельные срезы после окраски хромогеном докрашивали гематоксилином и эозином. Для оценки специфичности реакции проводили окрашивание отдельных срезов без первичных или вторичных антител. На контрольных срезах иммунопозитивная реакция отсутствовала.

Об уровне активации исследуемых ферментов судили на основании доли выявленных иммунопозитивных артерий мягкой оболочки мозга (пиальных) и внутримозговых артерий от общего числа встретившихся сосудов соответствующего порядка ветвления (диаметра), принятых за 100%, и относительной плотности капилляров (количество фрагментов на 1 мм²) в 5 неперекрывающихся полях зрения микроскопа (ув. 40). Затем производили расчет отношения МПП-2/ТИМП-2 [7] отдельно для иммунопозитивных пиальных ветвей разного диаметра, внутримозговых сосудов и капилляров.

Препараты просматривали под микроскопом Leica DMRXA («Leica», Германия) и фотографировали при помощи цифрового фотоаппарата Leica EC3 того же производителя. Количественную обработку проводили на пяти последовательных срезах каждого образца с использованием автоматизированной системы анализа изображения ImageScope («Leica», Германия).

Данные количественного анализа представляли в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего, полученных при обработке образцов каждого животного. Для оценки значимости цифровых данных применяли t-критерий Стьюдента. Значения считали статистически достоверными при р<0,05.

В материалах 2-й (контрольной) группы сосуды, содержащие ММП-9 и ТИМП-1, постоянно не встречались. В отличие от них, иммуногистохимический маркер ММП-2 и ТИМП-2 выявлялся в пиальных ветвях разного диаметра и внутримозговых артериях как в 1-й, так и во 2-й группах (рис. 1, а—е).

При хроническом воздействии табачного дыма (1-я группа) локализация ММП-2 в стенке сосудов существенно не менялась, однако значительно увеличивалось количество иммунопозитивных пиальных артерий, прежде всего крупных (см. рис. 2, а). Так, по сравнению со 2-й группой, доля пиальных ветвей I и II порядка у крыс 1-й группы возрастала на 37,2 и 20,4% соответственно (р<0,05), тогда как доля ветвей III порядка увеличивалась только на 13% (р<0,05), а IV и V порядка — на 4—7% (р>0,05). Содержание ММП-2-иммунопозитивных внутримозговых артерий возрастало на 15,2%, капилляров — на 18,5% (р<0,05), многие из которых отличались высокой интенсивностью реакции (см. рис. 1, д).

Количество сосудов, маркированных ТИМП-2, при хроническом воздействии табачного дыма, напротив, сокращалось. В материалах 1-й группы среди пиальных ветвей I и II порядка наблюдалось наиболее выраженное снижение (на 24,7 и 15,2% соответственно) этого показателя (рис. 2, б). Это обусловлено тем, что во многих крупных пиальных артериях в местах наибольшей концентрации соединительной ткани (наружной оболочке) преципитат чаще всего не откладывался. Тонкий и рыхлый слой его гранул выявлялся в эндотелии и, реже, в узкой прослойке подэндотелиальной выстилки этих сосудов (рис. 1, е). В пиальных ветвях III и V порядка, маркированных ТИМП-2, наблюдались во многом сходные преобразования локализации фермента, однако их доля сокращалась в меньшей степени (в среднем на 10—12%), внутримозговых артерий — на 14,1%, капилляров — на 15,7% (р<0,05).

Наличие локальных особенностей экспрессии рассмотренных выше ферментов у крыс 1-й группы привело к появлению значительных колебаний величины показателя, характеризующего отношение ММП-2/ТИМП-2 в разных отделах сосудистого русла (см. рис. 2, в). Его значения в пиальных ветвях I и II порядка превышали контрольные в 1,5—2 раза, в пиальных ветвях IV и V порядка и внутримозговых артериях — в 1,3 раза (р<0,05) и капиллярах — в 1,7 раза (р<0,05), тогда как в ветвях III порядка не отличались от контроля (р>0,05).

При выявлении ММП-9 и ТИМП-1 в 1-й группе отложение продукта реакции наблюдалось в стенках крупных и мелких пиальных ветвей, внутримозговых артерий и капилляров (рис. 3, а—г).

Индукция ТИМП-1 чаще наблюдалась в стенке крупных пиальных ветвей I и II порядка (см. рис. 4, а), в которых преципитат откладывался преимущественно в наружной оболочке сосудов (см. рис. 3, в). Доля мелких пиальных и внутримозговых артерий, содержащих ТИМП-1, составила 6—8%. ТИМП-1-позитивных капилляров также немного (106,5±10,2 на 1 мм²), причем в большинстве из них плотность отложения преципитата была невысокой (см. рис. 3, г). Колебания значений отношения ММП-9/ТИМП-1 в разных отделах сосудистого русла оказались значительными (рис. 4, б). В мелких пиальных ветвях и внутримозговых артериях величина этого показателя в 2—3 раза превышала значения, установленные в пиальных ветвях I и II порядка (р<0,05).

Полученные данные показывают, что у интактных животных в стенке пиальных и внутримозговых артерий ММП-2 и ТИМП-2 выявляются преимущественно в местах скопления соединительной ткани. Экспрессия обоих ферментов в крупных артериях мягкой оболочки мозга наблюдается почти в 2 раза чаще, чем в мелких пиальных ветвях и внутримозговых артериях, в которых фибриллярный компонент представлен весьма скудно [12, 13]. У животных контрольной группы количество сосудов соответствующего типа, маркированных ММП-2 и его тканевым ингибитором ТИМП-2, отличалось незначительно, что позволяет поддерживать базовый уровень обмена белков матрикса и нормальное функционирование сосудов.

При чрезмерной экспрессии ММП отмечается разрушение всех основных компонентов соединительнотканного матрикса — коллагена, фибронектина, ламинина [3, 4]. Расщепление ламинина при активации ММП-2 снижает жизнеспособность контактирующих с ним клеток, а диссоциация белка ZO-1 посредством ММП-9 вызывает увеличение проницаемости эндотелия, подавление продукции АТФ и деструкцию базальной мембраны микрососудов [14, 15]. Нарушение трансваскулярного транспорта, наблюдающееся в этих случаях, нередко сопровождается воспалительными и ишемическими процессами в нервной ткани [8, 9]. Фармакологическая или генетическая индукция тканевых ингибиторов ММП уменьшает отек и объем деструктивных изменений головного мозга [8, 16]. Помимо ТИМП, содержание ММП может регулироваться гепарином, поступающим из тучных клеток наружной оболочки сосудов или периваскулярной нервной ткани [13, 17], а также глюкокортикоидами, эстрогенами, прогестероном [5].

Многие хронические заболевания сопровождаются увеличением экспрессии специфических ферментов межклеточного матрикса [1, 2, 4, 6]. Агрессивные поллютанты табачного дыма (бензопирен, пероксинитрит, акролеин, цианиды, пероксиды и др.) при длительном воздействии также активируют ММП, способствуя развитию необратимых изменений эндотелия, гладкомышечных клеток и внеклеточного матрикса стенки сосудов [11, 18], вызывая когнитивные расстройства [19, 20]. Тем не менее иммунолокализация и количественное содержание этих ферментов в пиальных и внутримозговых сосудах у хронических курильщиков до сих пор специально не исследовались.

По данным настоящего исследования, при хроническом воздействии табачного дыма локализация ММП-2 в крупных пиальных ветвях I и II порядка не ограничивается субэндотелиальным слоем и наружной оболочкой, а появляется в эндотелии и гладкомышечных клетках средней оболочки. На поверхности эндотелиальных клеток ММП-2 взаимодействует с рецепторным белком интегрином αVβ3 (CD61), что приводит к значительной активации желатиназы [9]. В результате этих процессов наблюдается повреждение внутренней выстилки сосудов, развиваются воспалительные реакции в стенке артерий, отмечаются адгезия лейкоцитов к эндотелию и их превращение в пенистые клетки, которые стимулируют миграцию и пролиферацию мышечных клеток [20, 21].

Разнообразные и нередко тяжелые изменения церебральной гемодинамики, наблюдающиеся при хроническом табакокурении, могут усугублять дисбаланс, возникающий между ММП и ТИПМ в стенке сосудов, способствуя развитию эндотелиальной дисфункции [11, 18, 20]. Проведенные в настоящем исследовании подсчеты показали, что в 1-й группе среди позитивных по ММП-2 сосудов в наибольшей степени возрастает доля пиальных ветвей I и II порядка, тогда как доля таких же ветвей, но содержащих ТИМП-2, наоборот, сокращается, нарушая таким образом физиологический баланс между этими двумя ферментами. При изменении эквимолярного соотношения ММП и ТИМП в тканях развиваются фиброз, эластоз и другие нарушения внеклеточного матрикса [4, 9]. В мелких пиальных ветвях отмеченные различия выражены в меньшей степени, но вновь возрастают во внутримозговых артериях и капиллярах, что может быть связано с нарушением функций этих сосудов [14, 15].

ММП-2 и ММП-9 относятся к одному подсемейству ферментов и обладают сходной субстратной специфичностью, тем не менее в организме выполняют разные функции. МПП-9 вырабатывается в основном клетками воспаления и экспрессируется в поврежденных артериях, благодаря чему относится к маркерам системного воспаления [2, 3, 8]. Его активация нередко рассматривается в качестве предиктора сосудистых катастроф, поскольку коллагены IV и V типа, эластин и фибронектин содержатся в базальных мембранах сосудов и периваскулярной ткани. Вероятно, поэтому ММП-9 и ТИМП-1 в сосудах головного мозга у контрольных крыс выявляются крайне редко. Индукция этих ферментов наблюдается лишь в сосудах с деструкцией внеклеточного матрикса, которые в небольшом количестве наблюдаются и у интактных животных.

При длительной экспозиции табачного дыма плотное отложение осадка, маркирующего локализацию ММП-9, установлено в стенке всех исследованных типов сосудов, что подтверждает участие фермента в системном поражении сосудистого русла мозга. Но наиболее часто наличие ММП-9 было отмечено в мелких пиальных и внутримозговых артериях. Следовательно, основной мишенью для ММП-9 являются небольшие по диаметру сосуды, что может способствовать развитию у курильщиков артериальной гипертензии, при которой, как известно, в первую очередь поражается терминальная часть сосудистого русла. На ММП-9 реагируют также многие капилляры коры головного мозга. ММП-9 выявляется в эндотелии и перицитах капилляров мозга, в нейронах, а ММП-2 — в ножках астроцитов [15], т. е. хроническое воздействие табачного дыма может оказывать влияние на все элементы нейрососудистых единиц. ТИМП-1 выявляется в значительно меньшем количестве пиальных и внутримозговых артерий, чем маркированный ММП-9. Капилляров, позитивных по ТИМП-1, также немного, причем подавляющее большинство из них отличается невысокой интенсивностью реакции.

В настоящее время представлены доказательства связи экспрессии ММП-9 с выраженностью деградации внеклеточного матрикса [1, 2]. Усиление его деградации при патологии является результатом сложного каскада реакций, в которых, помимо ММП-9, участвуют многие другие индуцируемые ММП (ММП-3, ММП-7, ММП-14), действующие синергично. Связываясь со специфическими рецепторами, они вызывают преобразование различных его компонентов, однако решающим фактором протеолитической активности ММП является не столько уровень их экспрессии в тканях, сколько наличие баланса между ними и их эндогенными ингибиторами [4, 7, 8]. Дисрегуляторные явления, возникающие при нарушении такого баланса как при разнонаправленном, так и однонаправленном изменении экспрессии указанных ферментов, напрямую связаны с риском развития осложнений и неблагоприятным прогнозом при патологии [2, 6]. Важно и то, что в разных сегментах артериального русла мозга в настоящем исследовании была установлена различная степень выраженности этого дисбаланса. Учитывая различную роль крупных и мелких пиальных сосудов, внутримозговых артерий и капилляров в кровоснабжении головного мозга [12, 13], можно утверждать, что отмеченные особенности реакции исследуемых ферментов на продукты сгорания табачного дыма способны привести к разбалансировке единой системы регуляции гемодинамики и инициировать тяжелые изменения метаболизма головного мозга.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (№ 14−33−00009).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: chertokv@mail.ru