Умственная отсталость (УО) представляет собой группу синдромов и расстройств, характеризующихся низким интеллектом и связанными с ним ограничениями в адаптивном поведении [1].

Клиническая диагностика УО основана на вычислении коэффициента интеллекта (IQ). Диагноз ставится в случае, если IQ ниже 70 и есть существенные ограничения в деятельности, влияющие на повседневную жизнь [2]. В раннем детстве диагноз ставится при наличии отставаний в моторном и когнитивном развитии, а также задержке развития речи. По данным некоторых авторов [3—5], частота УО в населении колеблется от 1 до 4%. В последние несколько десятилетий распространенность УО стала расти, что скорее всего связано с большей осведомленностью и более тщательной диагностикой [6, 7].

Некоторые исследователи [8], поддерживая парадигму de novo УО, считают, что увеличение частоты развития этого заболевания можно объяснить только случайными доминантными мутациями [8].

Этиология УО различна; выделяют следующие причины:

— внешние факторы (пре-, пери- и постнатальные);

— интоксикация матери во время беременности (алкоголь, наркотики);

— недоношенность;

— фетальная инфекция (цитомегаловирусная, токсоплазмоз);

— пери- и постнатальная травма, сосудистые кризы, асфиксия;

— послеродовые инфекции;

— хромосомные аномалии;

— трисомия 21;

— анеуплоидии хромосомы Х;

— частичные трисомии (4p, 9q);

— частичные делеции (5p / Cri du chat);

— транслокации;

— микроделеционные синдромы;

— дерегулирование импринтированных генов (однородительская дисомия, потеря гетерозиготности, дефект импринтинга);

— синдром Прадера—Вилли;

— синдром Ангельмана [9];

— моногенные;

— аутосомно-рецессивные;

— аутосомно-доминантные;

— Х-сцепленные.

Несмотря на наличие разработанных методов определения УО и ее тяжести, причины УО часто остаются невыясненными [10, 11]. При этом в большинстве случаев причинами являются генетические нарушения, такие как анеуплоидия и хромосомные мутации, а также генные мутации. Клиническая и генетическая гетерогенность УО зачастую не позволяют установить диагноз без молекулярно-генетической диагностики. Более того, дети с разными формами несиндромальной УО клинически неразличимы [12] и часто имеют сочетанную патологию. Так, C. Gillberg и соавт. [13] на выборке из 149 детей показали, что 64% с тяжелой и 57% со средней степенью УО имеют сопутствующие психические нарушения, а аутистическое поведение характерно для большинства детей с тяжелой У.О. Все это не позволяет сузить перечень проверяемых генов или мутаций при диагностическом поиске и для установления диагноза требуется использование таких методов анализа ДНК, как полноэкзомное и полногеномное секвенирование.

Большой вклад в недифференцированную УО вносят тонкие хромосомные перестройки [14]. При этом каждая отдельная перестройка встречается редко и их диагностика до последнего времени была невозможна. Однако часто у таких пациентов, помимо УО, имеются признаки хромосомной патологии, поэтому при подозрении на хромосомные перестройки использует хромосомный микроматричный анализ. По данным литературы, с его помощью диагноз удается поставить в 17—24% случаев несиндромальной и синдромальной УО [15, 16]. В российской популяции у детей с УО, эпилепсией и аутизмом хромосомные перестройки удавалось выявить в 48% случаев, при этом в 28% они были признаны клинически значимыми [17]. Однако при проведении анализа у пациентов с идиопатической УО диагноз удалось поставить в 20,4% случаев [18].

Случаи изолированной УО представляют наибольшую сложность при диагностическом поиске. Причиной заболевания в таких случаях чаще всего является генная мутация, для поиска которой наиболее целесообразно использовать массовое параллельное секвенирование (МПС)^​1​᠎ [19]. При разработке и использовании диагностического метода, основанного на МПС, регулярно встают вопросы выбора между панелями генов и секвенированием всего генома, интерпретации получаемых данных и оптимизации алгоритма диагностического поиска.

В этом обзоре рассмотрены особенности использования генных панелей, секвенирования экзома и генома, достоинства и недостатки каждой из технологий. Описаны также особенности интерпретации огромного массива данных МПС и обсуждается оптимальный диагностический алгоритм, который поможет врачам в выяснении генетической причины УО.

Диагностика. Панель, экзом, геном. Существует множество доступных молекулярно-генетических тестов на УО, включая анализ мутаций в одном гене, в генных панелях и секвенирование экзома или генома. При этом врачу приходится решать проблему выбора наиболее точного диагностического инструмента для своих пациентов с генетическими заболеваниями [20]. Если удается выявить клиническую картину, для которой характерны мутации в определенном гене, можно назначить анализ отдельных мутаций или секвенирование всей последовательности гена. Иногда генетическая гетерогенность заболевания обусловливает необходимость анализа нескольких генов одновременно — так называемых генных панелей. В наиболее сложных случаях, например, при изолированной недифференцированной УО вследствие мутации в одном из 1700 генов, для которых показана связь с УО, врачам приходится назначать полноэкзомное секвенирование. Этот дорогостоящий метод не только расширяет диагностические возможности, но и позволяет открывать новые мутации и гены, связанные с развитием УО.

На российском рынке представлены различные панели генов для диагностики несиндромальной УО, X-сцепленной УО, УО и аутизма. Все они включают различные количества и комбинации генов и имеют разную диагностическую ценность.

Первые генные панели появились еще до внедрения МПС. Например, F. Hamdan и соавт. [21] отобрали 197 генов, кодирующих глутаматные рецепторы и взаимодействующие с ними белки. С помощью секвенирования по Сэнгеру отобранные гены были проанализированы у 49 пациентов с УО. В результате было найдено 23 тыс. вариантов, из которых 6 оказались мутациями сплайсинга, 6 — миссенс- и нонсенс-мутациями. Диагноз смогли поставить 5 пациентам, таким образом диагностическая значимость генной панели составила 10%. С учетом, что в панель включен только узкий класс генов, результат оказался достаточно успешным, однако сложность и дороговизна метода не позволили применять его для диагностики.

МПС позволяет секвенировать панели генов за цену, сопоставимую с ценой секвенирования по Сэнгеру одного гена среднего размера. C. Redin и соавт. [22] создали панель из 217 генов, в которых наиболее часто выявляются мутации при У.О. Диагностика у 116 пациентов оказалась успешной в 25% случаев при гораздо меньшей стоимости исследования по сравнению с экзомным секвенированием. В другой работе [23] были приведены результаты секвенирования 107 генов, расположенных в хромосоме Х у пациентов с УО. В когорте исследованных пациентов было 150 мужчин, из них 100 со спорадическим характером заболевания и 50 с семейной историей сегрегации заболевания по Х-сцепленному типу. В результате у пациентов 1-й группы было обнаружено 5 патогенных вариантов (успешная диагностика 5%), а у 2-й — 13 (успешная диагностика 26%). Полученные результаты дают основание сделать вывод, что при назначении исследования с использованием подобной панели необходимо руководствоваться не только частотой Х-сцепленной УО, но и доказательством того, что заболевание сцеплено с хромосомой Х. То же касается и остальных панелей: их диагностическая значимость высока лишь при соблюдении строгих критериев формирования выборки, что часто невозможно в повседневной практике. Более того, само название «недифференцированная УО» свидетельствует, что разделить пациентов на подгруппы крайне сложно, а, значит диагностическая ценность любой генной панели будет оставаться сравнительно низкой, и целесообразнее проводить полноэкзомное секвенирование.

В 2011 г. H. Najmabadi и соавт. [24] провели крупнейшее на тот момент исследование по выявлению новых мутаций при У.О. Они отсеквенировали экзомы 136 семей с близкородственными браками и аутосомно-рецессивной УО. В результате были обнаружены мутации в 23 генах, ранее ассоциированных с У.О. Например, ген SLC2A1, кодирующий транспортер глюкозы, PRKRA, играющий роль при дистонии, и MED13L, ранее ассоциированный с УО и патологией сердца, в данном исследовании показали ведущую роль при несиндромальной У.О. Кроме того, были обнаружены мутации в 50 новых генах-кандидатах, многие из которых взаимодействуют с продуктами генов, вовлеченных в УО, или являются участниками жизненно важных клеточных процессов.

Экзомное секвенирование несмотря на свои преимущества создает иную проблему — избыток найденных у пациента вариантов, которые трудны для клинической интерпретации. Существенно упростить анализ получаемых данных позволяет одновременное секвенирование экзома пробанда и его родителей (так называемый анализ трио). В таком случае можно сразу проверить гипотезы о типе наследования и выявить у пробанда потенциально патогенные варианты de novo. H. Lee и соавт. [25] показали, что мутацию, приводящую к УО, удается выявить в 41% случаев секвенирования трио, в то время как при секвенировании только пробанда мутацию находят лишь у 9% пациентов.

Регионы, кодирующие белок, составляют примерно 1,5% человеческого генома или 50 млн нуклеотидов, и содержат около 200 тыс. экзонов. Более 85% известных патогенных мутаций приходится на кодирующие области генома [26]. Таким образом, экзомного секвенирования должно быть достаточно для выявления большинства генетических мутаций; кроме того, во многие экзомные панели включены некоторые нетранслируемые области с ранее описанными в них мутациями. Тем не менее, по данным некоторых авторов [27], 77% мутаций de novo, обнаруживаемых при полногеномном секвенировании, остаются невыявленными при экзомном секвенировании. Сходные результаты были получены S. Soden и соавт. [28], которым при сравнении результатов секвенирования экзома и генома при анализе трио молекулярный диагноз удалось установить у 45 и 73% пробандов соответственно.

C. Gilissen и соавт. [29] провели полногеномное секвенирование у 50 пациентов с УО, у которых не нашлось мутаций в результате экзомного секвенирования, хромосомного микроматричного анализа и применения других методов. Исследователи сфокусировали свое внимание на списке из 1158 генов, в которых мутации, по их мнению, могли приводить к УО, и в результате диагностика оказалась успешной у 42% пациентов.

Почему геномное секвенирование обладает большей диагностической ценностью по сравнению с анализом экзома? Это обусловлено тем, что любая технология обогащения последовательностей (а экзомное секвенирование выполняют на предварительно обогащенных образцах ДНК) несовершенна и приводит к потерям информации. Секвенирование всего генома обеспечивает равномерное и качественное прочтение всех участков, в том числе сложных и повторяющихся последовательностей, границ экзонов и других участков, пропускаемых при экзомном секвенировании. Поэтому полногеномное секвенирование позволяет находить мутации в тех случаях, когда экзомное секвенирование дало отрицательный результат.

Важно также отметить, что технологии обогащения экзома различаются у разных разработчиков, и, следовательно, различаются доступные для анализа экзоны и целые гены. В некоторых случаях перечень генов сокращают до 4—5 тыс. наиболее хорошо охарактеризованных и связанных с заболеваниями генов, в таких случаях экзом называют клиническим.

Мы сравнили перечни генов в нескольких наиболее распространенных наборах для анализа полного экзома. На рис. 1 (см.)

Таким образом, с одной стороны, перечень генов и мутаций, связанных с УО, постоянно изменяется и растет, что не позволяет пока создать идеальную диагностическую панель. С другой стороны, продолжающееся снижение стоимости секвенирования, а также накопленные данные о преимуществах полногеномного секвенирования и секвенирования трио (пробанд и родители) позволяют считать их методами выбора при диагностике такой гетерогенной патологии, как У.О. Применение панелей размером в несколько десятков, а тем более несколько единиц генов является неоправданным шагом с точки зрения итоговой диагностической ценности панели. Кроме того, экзомное/геномное секвенирование позволяет пересматривать однажды полученные результаты по мере накопления данных и устанавливать диагноз в случае описания новых генов и мутаций, связанных с УО.

Интерпретация результатов секвенирования. Результатом массового параллельного секвенирования является набор генетических вариантов, которые отличают анализируемые гены или весь геном пациента от референсного генома. Например, для экзома количество найденных вариантов в среднем превышает 30 тыс. Соответственно одной из сложнейших задач для исследователя является интерпретация находок и выявление 1—2 патогенных вариантов среди десятков тысяч безвредных полиморфизмов. Существует множество протоколов поиска и оценки патогенности мутаций. Рекомендации по интерпретации данных разрабатывают и постоянно обновляют ассоциации клинических молекулярных генетиков Англии и Американского колледжа медицинской генетики [30—32]. В России также опубликованы рекомендации, созданные на базе соответствующих американских и английских материалов [33]. При практическом использовании протоколы корректируются для интерпретации вариантов при диагностике каждого конкретного заболевания, например муковисцидоза [34], УО [35], предрасположенности к раку [36—37] и других заболеваний. В частности, для диагностики УО был предложен протокол, представленный на рис. 2 [27].

Следует отметить существенный недостаток предложенного подхода — использование в основе анализа программ — предсказателей патогенности, которые зачастую дают как ложноотрицательные, так и ложноположительные результаты. Предпочтительнее в оценке патогенности опираться на популяционные частоты вариантов, что отражено в отечественных рекомендациях [33], а результаты программ-предсказателей учитывать, как вспомогательную информацию.

В последние годы наблюдается резкое увеличение числа работ, посвященных МПС при психических заболеваниях [38] (рис. 3, а,),

По итогам анализа данных МПС постоянно пересматривают ассоциации вариантов в генах с болезнями. Благодаря проектам «1000 геномов» [40] и «ExAc» [41], многие считавшиеся ранее патогенными варианты перешли в класс непатогенных, так как на самом деле имеют достаточно высокую популяционную частоту, не сопоставимую с частотой заболевания.

F. Hamdan и соавт. [42] утверждают, что ключевую роль в развитии средней и тяжелой УО играют мутации de novo. Исследователи провели полноэкзомное секвенирование у 41 пробанда и их родителей и обнаружили у пациентов от 0 до 7 вариантов de novo. Очевидно, что у одного человека патогенной может оказаться только одна мутация, крайне редко встречается комбинация наследственных заболеваний. Для того чтобы окончательно понять, имеет ли мутантный ген отношение к болезни, обязательно нужно выяснить его функцию. Если ранее не были описаны хотя бы 3 пациента с мутацией в одном гене, то ген можно отнести лишь к генам-кандидатам, при условии, что в нем есть мутация, прогнозируемая как патогенная. Так, в недавнем исследовании H. Stessman и соавт. [43] создали панель из 208 таких генов-кандидатов и испытали ее на 11 730 пациентах с УО и 2807 контрольных образцах. Результатом работы стало открытие 38 новых генов, связанных с синдромальной и несиндромальной У.О. Установлено, что гены, вызывающие так называемые менделевские заболевания, менее толерантны к функциональным генетическим вариациям [44], следовательно в таких генах реже происходят мутации любого рода по сравнению с остальными, т. е. они более консервативны. Это может быть использовано при поиске новых генов, связанных с «менделевскими» заболеваниями, в том числе с УО.

МПС является высокоточным методом, однако, как и любой метод, не застрахован от ошибок. Ошибки секвенирования возникают с частотой 0,8—1,71%, в зависимости от платформы [45]. С учетом производительности в десятки тысяч вариантов на один образец это ведет к неминуемому наличию ошибки в каждом образце, поэтому все найденные варианты необходимо проверять зарегистрированным для клинической диагностики методом секвенироваия по Сэнгеру. В упомянутом ранее исследовании F. Hamdan и соавт. [42] при использовании секвенирования по Сэнгеру подтвердили 81 (97,6%) из 83 найденных мутаций de novo.

Для диагностики некоторых заболеваний, имеющих многофакторную или полигенную природу, применяют нейросети [46, 47]. Они работают путем поиска соответствия анализируемых данных определенной модели, сформированной в процессе предварительного обучения на хорошо охарактеризованной выборке реальных данных, полученных от пациентов и здоровых лиц. Возможно, в будущем в качестве входных данных можно будет использовать набор вариантов, выявленных при МПС, и диагностика УО, аутизма и других психических и неврологических заболеваний станет намного проще. Пока наиболее широко применяемым врачами инструментом является сервис Face2gene (FDNA, США), работающий отчасти по принципам, сходным со сравнением фотографии пациента с искусственными сборными портретами-моделями различных наследственных заболеваний. При этом портрет-модель конкретного заболевания постоянно усовершенствуется в ходе работы с программой и внесения новых данных. Кроме того, программа позволяет учитывать прочие симптомы, а также данные лабораторных исследований, в том числе результаты полноэкзомного секвенирования.

Большинство случаев УО невыясненной этиологии обусловлено генетическими нарушениями. При этом до недавнего времени из-за высокой генетической гетерогенности заболевания большинство мутаций не удавалось определить. Методы массового параллельного секвенирования резко изменили ситуацию с молекулярно-генетической диагностикой У.О. Стало возможным искать мутации более чем в 1,5 тыс. генов, связанных с развитием УО. В значительной части случаев заболевание обусловлено мутациями de novo. Несмотря на диагностическую мощность новых методов, следует сохранять общий подход к диагностике У.О. При наличии множественных признаков дизэмбриогенеза рекомендуется проводить кариотипирование, а при его неэффективности — хромосомный микроматричный анализ. В некоторых случаях возможно заподозрить один из частых синдромов и по возможности назначить тест на известную мутацию. Однако зачастую врач сталкивается с изолированной недифференцированной УО, и в такой ситуации целесообразно начинать диагностический поиск с полноэкзомного анализа. Максимальной диагностической ценностью обладает полногеномный анализ трио, но, к сожалению, этот подход остается практически недоступным в России из-за высокой стоимости.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail:olevchenko@med.gen.ru