Среди бактерий, вызывающих заболевания пищевого происхождения, L. monocytogenes, по данным ВОЗ от 30.04.20, относится ко второй группе опасности, уступая первенство только группам Salmonella, Campylobacter, энтерогеморрагической E. coli (EHEC) (https://www.who.int/NEWS-ROOM/FACT-SHEETS/DETAIL/FOOD-SAFETY).

Микробиологический контроль продуктов питания в нашей стране организован от этапа производства и транспортировки до хранения в торговой сети и проводится в соответствии с регулярно обновляемым Техническим регламентом Таможенного союза ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» (с изменениями от 08.08.19) и СанПиН 3.3686—21 «Санитарно-эпидемиологическими требованиями по профилактике инфекционных болезней». Мясо и мясную продукцию контролирует отдельный документ — ТР ТС 034/2013 Технический регламент Таможенного союза «О безопасности мяса и мясной продукции». Выделение и идентификацию листерий определяет ГОСТ 32031—2012 (с Поправкой ИУС N 6-2019, https://docs.cntd.ru/document/1200105310), являющийся межгосударственным стандартом для стран Евразийского союза.

Следует подчеркнуть, что контроль производственной среды является ключевым моментом в технологической цепочке, поскольку персистенция листерий на производстве увеличивает вероятность кросс-контаминации готовой продукции.

Для стран Евросоюза контроль производственной среды в отношении L. monocytogenes является предметом особого внимания. Контролю подлежат также два других вида кластера Listeria sensu strictu [1]: L. innocua и L. welshimeri как индикаторы контаминаци/колонизации L. monocytogenes среды производства [2]. Бактерии генотипов, выявляемых несколько раз в течение 6 и более месяцев, определяют как персистирующие контаминанты, а генотипов, детектированных однократно в течение 2 и более лет, как неперсистирующие [2]. Молекулярные методы, позволяющие определить генотип, были внедрены ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control) в надзор за патогенами пищевого происхождения в странах ЕС/ЕЭЗ (Европейского Союза/европейской экономической зоны) в 2012 г. В марте 2019 г. ECDC ввел полногеномное секвенирование (whole genome sequencing, WGS) в надзор за инвавзивным листериозом в ЕС/ЕЭЗ. В 2021 г. в разгар пандемии COVID-19 ECDC провел 7-й этап внешнего контроля качества национальных референсных лабораторий в отношении серологических и молекулярных методов исследования листерий (https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/listeria-monocytogenes-typing-seventh-external-quality-assessment-scheme/).

В США первые правила профилактического контроля за пищевыми продуктами, включая наблюдение за L. monocytogenes на предприятиях пищевой промышленности, были приняты в 2011 г. (https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidancedocuments/draft-guidance-industry-control-listeria-monocytogenes-ready-eat-foods). В 2019 г. Управление по контролю за продуктами и лекарствами (FDA, Food and Drug Administration) опубликовало правила безопасности продуктов, определяющие стратегию контроля от выращивания животных до пищевого производства, включая контроль оборудования, инструментов и помещений (https://www.fda.gov/food/food-safetymodernization-act-fsma/fsma-final-rule-produce-safety). Наличие системы PulseNet, располагающей базой геномных данных бактерий, вызвавших заболевания пищевого происхождения, а также сетью лабораторий, выполняющих WGS, позволяет оперативно проводить исследования генетического родства листерий, выделенных от заболевших и из продуктов. В 2021 г. эффективность такого подхода показало расследование вспышки листериоза в 4 штатах, вызванной употреблением свежих и мягких сыров марки El Abuelito (https://www.cdc.gov/listeria/outbreaks/hispanic-soft-cheese-02-21/index.html).

Полногеномное секвенирование листерий стало одним из инструментов в многоцентровом исследовании, в которое включился НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи в конце 2018 г. [3]. WGS дополнил методы мультилокусного секвенирования (MultiLocus Sequence Typing, MLST) и секвенирования локусов вирулентности (Multivirulentlocus sequence typing, MvLST), определяющие генотип (Sequence Type, ST) листерий и профиль интерналинов (IP, Internaline Profile), белков, обеспечивающих инвазию листерий в эукариотические клетки. Молекулярно-генетические данные позволили охарактеризовать клинические и пищевые изоляты L. monocytogenes Московского региона в период до COVID-19 и в течение пандемии [4]. Накопленный опыт мы применили в пилотном исследовании изолятов двух мясоперерабатывающих производств Москвы. Цель работы — определение генетических характеристик листерий, выделенных из смывов, выполненных на разных участках производств, как основы для дальнейшего наблюдения за листериями персистирующих генотипов.

Материал и методы

Организация отбора проб на мясоперерабатывающих производствах. Два мясоперерабатывающих производства Москвы обследовали в 2019—2020 гг. В качестве сырья оба предприятия использовали свинину, птицу (производства России) и говядину (производства России и Белоруссии). Объекты контроля производственной среды выбирали в соответствии с принципами зонирования. Характеристика зон и выявленные изоляты представлены в табл. 1. Для смывов использовали стерильные губки, пропитанные летиновым бульоном (3M Hydrated-Sponge with 10 mL Letheen Broth, 3M Science. Applied to Life, США). Компоненты бульона (лецитин и полисорбат 80) нейтрализуют четвертичные аммониевые соединения, гексахророфен, используемые для дезинфекции производственной среды, а также фенольные дезинфектанты и формалин, применяемые для дезинфекции в медицинских учреждениях. На предприятии I собрали 41 смыв, а на предприятии II — 38 смывов.

Исследование смывов на наличие Listeria spp. Обогащение. Губки, использованные для смывов, помещали в 225 мл бульона LPT (LPT broth, bioMerieux, Франция), предназначенного для селективного обогащения Listeria spp., перемешивали с помощью блендера AES MIX2 Lab Blender (American Laboratory Trading, США) и инкубировали в BINDER BD 115 Avantgarde (BINDER GmbH, Германия) при температуре 37±1 °C в течение 18—24 ч.

ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ) проводили с применением реактивов и прибора GENE-UP (bioMerieux, Франция). 20 мкл обогащенной культуры лизировали с помощью GENE-UP Lysis Kit. 10 мкл образца использовали для исследования с реактивами и по протоколу набора GENE-UP L. monocytogenes 2 (LMO 2).

Подтверждение положительных образцов проводили согласно ГОСТ 32031—2012.

Молекулярно-генетическая характеристика изолятов листерий. Мультилокусное секвенирование, включавшее анализ 7 генов домашнего хозяйства и 4 генов вирулентности (MLST, MultiLocus Sequence Typing, и MvLST, Multi-virulent-locus sequence typing), проводили, как описано ранее [5]. Анализ аллелей MLST и аллельных профилей (ST, Sequence Type) выполняли с помощью ресурсов Bacterial Isolate Genome Sequence Database for L. monocytogenes (BIGSdb-Lm) (https://bigsdb.pasteur.fr/listeria/) [6]. Проанализированные изоляты и новые аллельные профили депонировали в базе данных сайта: ID 49188—49201, 49206.

Амплификацию и секвенирование локуса abcZ (ABC транспортер) для L. welshimeri проводили с разработанными нами праймерами abcZF216 (TTGGATGCTGATTCTCTGCT) и abcZ R897 (YGAATATTGAACGAACATAACG), поскольку праймеры, предложенные M. Ragon и соавт. [7] для L. Monocytogenes, не были комплементарны последовательности гена abcZ L. welshimeri.

Аллели MvLST и IP (Internalin genes Profile (inlA, inlB, inlC, inlE)) определяли, используя в качестве референсов опубликованные последовательности [3, 5, 8—11]. Новые варианты аллелей inlA и inlE, выявленные в данном исследовании, зарегистрировали в GenBank (Accession Numbers: MT812686, MT812687).

Полногеномное секвенирование 2 изолятов L. welshimeri GIMC2049:LmcC11 и GIMC2051:LmcC15, выделенных на производстве II в 2020 г., выполняли на платформе MiSeq Illumina (картридж MiSeq v2 Reagent Kit 300 cycles, Illumina, США). Для приготовления библиотек фрагментов использовали набор KAPA HyperPlus (Roche, Швейцария). Качество и размер библиотек оценивали с помощью электрофореза на чипах High Sensitivity DNA Chips на приборе 2100 Bioanalyzer System (Agilent, США). Результаты секвенирования (Sequence Read Archive, SRA) депонировали в GenBank NCBI (BioProject ID: PRJNA658237).

Для сборки геномов использовали CLC Genomic Workbench v.20.0.4 (QIAGEN, США) и SPAdes v.3.13.0 0 (St. Petersburg genome assembler, Russia, URL: https://cab.spbu.ru/software/spades/). Для проверки результатов сборки применяли CGView Server (https://stothard.afns.ualberta.ca/cgview_server/) [12]. Аннотацию геномов выполняли с помощью сервера RAST (Rapid Annotations using Subsystems Technology) [13, 14]. Для поиска последовательностей профагов использовали PHASTER (PHAge Search Tool Enhanced Release, https://phaster.ca/) [15]. MLST корового генома (cgMLST) изолятов определяли с помощью ресурсов BIGSdb-Lm [6].

Результаты и обсуждение

Разнообразие генотипов изолятов листерий, выделенных на мясоперерабатывающих производствах. Листерии были выделены из 29% смывов на первом производстве и из 11% смывов на втором предприятии. Изоляты листерий, выделенные из производственной среды, преимущественно (81%) были представлены видом L. monocytogenes (см. табл. 1). 19% составили изоляты L. welshimeri. Генетическое разнообразие L. monocytogenes было характерно для производства I: у изолятов было определено 4 генотипа филогенетической линии II (ST8, 121, 321, 2330). Преобладали изоляты ST8, выявленные в смывах с поверхностей и колес тележек, стыков стола обвалки, клипсаторной машины. Следующие по частоте встречаемости изоляты ST321 отмечены на конвейерах. С колеса тележки и косяка двери были выделены изоляты ST121 и ST2330 (CC9 — Clonal Complex 9). На втором производстве преобладали L. welshimeri, представленные генотипами 1050 и 2331 и обнаруженные в смывах с корпуса мешалки, поверхности тележек и пластмассового контейнера. Изолят L. monocytogenes ST8 выделен из смыва с тележки.

Сравнение выделенных изолятов с российскими изолятами из других источников выделения. В настоящее время Listeria PasteurMLST database (https://bigsdb.pasteur.fr/, 27.07.22) содержит информацию о 288 изолятах из России. Анализ этих данных и публикаций показывает, что преобладавший в производственной среде ST8 во всех рассмотренных источниках (клинические изоляты от человека, изоляты из пищевых продуктов и окружающей среды) не встречался до пандемии COVID-19. Однако представители клонального комплекса 8 (CC8), отличающиеся от ST8 по 1 (SLV — single locus variant) или 2 (DLV — double locus variant) локусам, отмечены в единичных случаях во всех источниках: ST758 — в окружающей среде [8], ST2096 — в клиническом изоляте при менингите [3], ST16 — в пищевых продуктах [16]. В декабре 2021 — январе 2022 г. в клиниках Москвы отмечено 4 случая инвазивных листериозов, вызванных L. monocytogenes ST8 (ID 82490-82492, 82494). Следующий по численности на производстве ST321 обнаружен в России впервые.

Изоляты ST121 являются наиболее представленными в продуктах питания (мясе, птице, рыбе) как по нашим данным 2018—2019 гг. [3, 5], так и по данным ФБУН «ГНЦ ПМБ» Роспотребнадзора 2017 г. [16]. В других источниках ST121 не обнаружен.

ST2330 относится к CC9 и является SLV ST9 по локусу dat. Изоляты ST9 выделены в России из разнообразных пищевых продуктов [3, 5, 16, 17], а также из клинического материала при менингите в 2015 и 2016 гг. [16], однако изоляты CC9 не обнаружены в выборке клинических изолятов 2018—2019 гг. [3]. L. welshimeri среди российских изолятов отмечена впервые.

Анализ профилей интерналинов (IP) выделенных изолятов L. moncytogenes. Профили интерналинов (IP) представлены в табл. 1. Все изоляты ST8 имели одинаковый IP53, идентичный IP определен как у клинических изолятов ST8, так и у изолята ST2096 (CC8) [3], являющегося SLV по фрагменту гена cat. Профиль интерналинов изолята ST121 не отличался от IP48 изолятов этого генотипа, ранее выделенных из продуктов питания [5]. Для изолятов нового ST321 профиль интерналинов тоже оказался новым, аллель 21 inlA была определена впервые. У изолята ST2330 (CC9) IP отличался аллелью inlE от профиля изолятов ST9, выделенных из пищевых продуктов [5].

Таблица 1. Характеристика изолятов листерий, выделенных из смывов на мясоперерабатывающих производствах. Распределение по зонам отбора образцов

Примечание. ST — sequence type, CC — clonal complex, PL — phylogenetic lineage, IP — internalin profile. Полужирным шрифтом отмечены новые аллели, генотипы, IP. Серой заливкой выделены изоляты производства II.

Гены интерналинов inlA, inlB, inlC, inlE отсутствовали у изолятов L. welshimeri. Следует отметить, что если в геноме L. monocytogenes ST7 (клинический изолят GIMC2009:LmcUH4, GenBank Accession Number CP060435) было выявлено 32 гена интерналинов, то в геномах L. welshimeri GIMC2049:LmcC11 и GIMC2051:LmcC15 (ST2331 и ST1005, соответственно) обнаружено только 8 генов интерналинов. Все 8 транслированных полипептидов отвечали характеристикам интерналинов класса LPXTG [18]: имели сигнальный пептид на N-конце, область лейцин-богатых повторов (leucine-rich repeat, LRR), а также С-концевой сортинг-сигнал, определяющий ковалентное взаимодействие с пептидогликаном. Указанные полипептиды имели сходство с интерналинами L. monocytogenes в 49—89% случаев. Из остальных доменов, обнаруженных в 8 полипептидах, хорошо охарактеризован домен MucBP (муцин-связывающего белка), определяющий адгезию к муцинам слизи кишечника [18]. В трех интерналинах L. welshimeri мы выявили от 1 до 4 MucBP доменов.

Геномные характеристики изолятов L. welshimeri. L. welshimeri, выявленные на производстве II представлены 2 генотипами в контексте генов MLST: 1005 и 2331 (см. табл. 1). Анализ изолятов BIGSdb-Lm показал, что база данных вместе с введенными нами 3 изолятами содержит 19 изолятов L. welshimeri 7 разных генотипов, 42% из которых относятся к ST1005. Изоляты выделены преимущественно (84%) из среды пищевых производств. ST2331 был новым в этом списке.

Сравнение геномов секвенированных изолятов GIMC2049:LmcC11 и GIMC2051:LmcC15 с геномом референсного штамма L. welshimeri NCTC11857 (GenBank Accession Number LT906444), выделенного из гниющих растительных остатков, показало, что геномы очень близки по размеру хромосомы и меньше хромосомы L. monocytogenes EGD-e на 110706-145573 п.н., что связано с утратой генов основного острова патогенности листерий LIPI-1 [19]. Однако изолят ST2331 отличался наличием плазмиды. Плазмида размером 57530 п.н. по результатам BLAST была гомологична 8 плазмидам, депонированным в GenBank NCBI (табл. 2).

Таблица 2. Плазмиды листерий, гомологичные плазмиде L. welshimeri ST2331

Как видно из табл. 2, большинство плазмид выделено из изолятов L. monocytogenes двух филогенетических линий как от пациентов с листериозом, так и из продуктов и из окружающей среды. Одна плазмида была обнаружена в изоляте L. innocua. Следует отметить, что 4 изолята представляли CC3 первой филогенетической линии, а из 3 изолятов филогенетической линии II два изолята относились к клиническим. Большинство плазмид имело размер 57,6—57,8 т.п.н. за исключением pN1-011A, существенно превышавшей по размеру другие плазмиды группы. Сходство плазмид с плазмидой L. welshimeri ST2331 составило 99,88—99,94%. В плазмиде L. welshimeri ST2331 мы обнаружили остатки листерийного фага A006, гены белка Cas5, ассоциированного с CRISPR, Clp протеазы, NADH пероксидазы, токсина и антитоксина PemI/PemK (MazE/MazF), ABC-транспортера бетаина, АТФ-азы и регулятора транскрипции систем эффлюкса ионов тяжелых металлов (кадмия, цинка, свинца, ртути). Все эти белки необходимы для противостояния стрессам окружающей среды [20].

Геномы выделенных изолятов L. welshimeri ST2331 и ST1005 характеризовались наличием протяженного участка, включающего гены, ответственные за метаболизм кобаламина, этаноламина и пропандиола. Этаноламин и пропандиол являются продуктами анаэробной утилизации сахаров в кишечнике позвоночных и единственными источниками углерода, а также источником азота для бактерий, персистирующих в желудочно-кишечном тракте; кобаламин служит кофактором для двух указанных путей метаболизма [21]. Присутствие такого локуса генома является характерной чертой Listeria sensu strictu, к кластеру которых относится L. welshimeri. Заметим, что опероны, отвечающие за указанные пути метаболизма, в секвенированных геномах L. welshimeri содержат также гены, кодирующие белки, которые формируют селективно проницаемую икосаэдрическую белковую оболочку микрокомпартментов, в которых и протекают ферментативные реакции [22, 23]. Наличие таких микрокомпартментов, или полиэдральных структур размером 100—200 нм в поперечнике, также является отличительной чертой клеток бактерий, способных к выживанию в кишечнике позвоночных.

Кроме того, в геномах L. welshimeri ST2331 и ST1005 обнаружен оперон agrABCD, кодирующий систему белков (accessory gene regulator protein A, B, C, D), участвующих в непосредственной и опосредованной регуляции более 650 генов, ассоциированных с выживанием и конкурентным преимуществом в разных экологических нишах, адгезией к поверхностям, образованием биопленок, инвазией клеток, вирулентностью и глобальными изменениями в экспрессии генов [24, 25]. Таким образом, геномные характеристики выделенных изолятов L. welshimeri подтверждают широкие адаптивные возможности этого вида листерий.

Заключение

Пилотное исследование листерий в смывах, полученных на двух мясоперерабатывающих производствах Москвы, показало присутствие листерий в производственной среде и позволило описать их генетические характеристики, необходимые для текущего сравнения с отечественными и международными данными, а также для последующего отслеживания персистирующих генотипов. L. monocytogenes ST8, 321, 121 и CC9(ST2330), которые были обнаружены нами на производствах Москвы. По данным французских исследователей, полученным на 7342 изолятах Национального референсного центра Франции по листериям, L. monocytogenes CC121 и CC9 строго коррелируют с пищевыми продуктами, CC8 и 321 являются промежуточными, т.е. встречаются и в продуктах, и в клинических образцах [26]. В то же время в Австрии в мясной продукции чаще обнаруживали L. monocytogenes CC8 и 9 и реже CC121 [27], а в совместном исследовании коллекционных штаммов Канады и Швейцарии в пищевых продуктах лидировали L. monocytogenes CC8 и 9, менее часто детектировали CC321, а CC121 только в единичных случаях [28].

На пищевом производстве II мы выделили L. welshimeri двух генотипов: ST2331 и ST1005, геномные характеристики которых указывали на их адаптивные возможности как к условиям производства, так и к метаболическим особенностям желудочно-кишечного тракта животных. Исследование, проведенное на пищевых производствах Великобритании и Ирландии, также выявило среди персистирующих контаминантов L. welshimeri, содержащих гены устойчивости к дезинфектантам, кадмию, и плазмиды [2]. В ходе выполнения проекта Корнелльского университета (США) [29] было показано, что L. welshimeri, персистирующие в среде производства, по результатам полногеномного секвенирования отличаются от изолятов из почвы, что подтверждает эволюцию L. welshimeri при адаптации к условиям производства.

Таким образом, применение молекулярно-генетических методов способствовало выявлению разнообразия листерий на мясоперерабатывающих производствах, что заложило основу мониторинга безопасности среды пищевых производств.

Финансирование работы.

Работа выполнена при финансовой поддержке государственного задания №056-00034-20-00 ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Часть образцов собрана в рамках гранта 2020-1902-01-288 ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН, предоставленного Минобрнауки России 28 июля 2020 г.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.