Хроническая недостаточность мозгового кровообращения (ХНМК) наряду с болезнями Паркинсона и Альцгеймера является ведущей причиной снижения когнитивных способностей человека. Нарушения памяти и адаптивных возможностей, возникающие при ХНМК, приводят к утрате способности к самообслуживанию, что сопровождается снижением эффективности терапии основных и сопутствующих заболеваний, повышает риск смерти, инвалидизации и снижает качество жизни не только самого пациента, но и его родственников. Таким образом, разработка эффективных методов профилактики и лечения ХНМК представляется важной задачей современной медицины.

В то же время существующие методы экспериментального воспроизведения нарушений мозгового кровообращения, основанные на перевязке магистральных сосудов, представляют собой модели острой ишемии. Несмотря на их широкое применение в экспериментальной фармакологии [1, 2], данные методы не позволяют в полной мере оценить эффекты ноотропных препаратов. Более того, моделирование острого нарушения мозгового кровообращения на фоне введения ноотропных препаратов противоречит идеям о внешней, предиктивной и конструктивной валидности используемой модели [3]. С этих позиций более перспективным становится моделирование ХНМК, обладающих большим сходством с естественными патологическими процессами [4].

Цель настоящей работы — описание моторных, адаптивных и когнитивных нарушений, возникающих у животных с ХНМК, вызванным стенозом общих сонных артерий.

Исследование выполнено на 20 белых аутбредных крысах-самцах (ФГУП ПЛЖ «Рапполово», Ленинградская область, РФ, карантин 2 нед) в возрасте 6—7 мес, содержавшихся в виварии НИИ фармакологии ВолгГМУ на инвертированном световом цикле (12/12 ч, свет включается в 20:00) и стандартном комбикормовом рационе (ГОСТ Р 51849−2001, ООО «Лабораторкорм», Москва, Россия). Все эксперименты проводились с 10:00 до 18:00, в периоды максимальной активности животных. За сутки и за 2 ч до начала эксперимента животных переносили в экспериментальную комнату для 2-часовой габитуации к помещению лаборатории.

ХНМК вызывали путем частичного стенозирования общих сонных артерий (ОСА). В первой серии экспериментов (n=5) наркотизированное животное (хлоралгидрат, в/бр, 400 мг/кг) фиксировали, область шеи выбривали, обрабатывали раствором хлоргексидина биглюконата 0,05%. Затем проводили разрез кожи по срединной линии шеи, рассекали подкожную фасцию, слюнную железу отодвигали, выделяли сонный треугольник, образованный сверху двубрюшной мышцей, латерально — грудино-ключично-сосцевидной мышцей и медиально — грудино-подъязычной мышцей. Далее выделяли сосудисто-нервный пучок, образованный общей сонной артерией и блуждающим нервом, который орошали 2% раствором лидокаина. После выделения сонной артерии под нее подводили три лигатуры, располагаемые на расстоянии 2—3 мм друг от друга. Параллельно артерии закрепляли иглу (29G ½) от шприца (SFM Hospital Products GmbH), к которой привязывалась сонная артерия и которая затем убиралась таким образом, чтобы лигатуры оставались на заданном расстоянии. В результате описанных выше манипуляций кровоток по сонным артериям ограничивался в среднем на 50—60%, а в головном мозге — на 40—45% от изначальных значений.

Оценку уровня локального кровотока (ЛМК, у.е.) осуществляли до и после стенозирования сонной артерии в двух точках, сразу в месте после наложения лигатур и в проекции средней мозговой артерии (рис. 1). Регистрацию проводили с помощью лазерного допплерографа Biopac Systems, Inc. (США). Доступ к артерии создавался следующим образом: наркотизированному животному с использованием депиляционного крема удаляли шерстяной покров и кожный лоскут в верхней поверхности черепа, которая впоследствии скальпировалась. Далее с учетом стереотаксических координат, началом которых принималась точка Брегма, определялось место установки датчика (в проекции средней мозговой артерии), голова животного и датчик фиксировались в стереотаксической установке, трепанационное отверстие производилось конической зуботехнической фрезой. После операции животных выводили из эксперимента передозировкой хлоралгидрата (800 мг/кг внутривенно). Таким образом, нами было установлено, что ограничение кровотока по сонным артериям приводит к значительному снижению мозгового кровотока, который не восстанавливается в течение 80 мин.

В дальнейший эксперимент (вторая серия) брали животных (n=9), которым проводились аналогичные описанным выше мероприятия по ограничению кровотока, но его регистрацию для визуализации и последующей стандартизации стеноза осуществляли только в сонных артериях. После чего рану послойно ушивали, обрабатывали 0,05% раствором хлоргексидина биглюконата и 5% раствором йода, животных переносили в «домашние» клетки.

Интактная группа животных, аналогичных по весу, полу и возрасту, состояла из 6 особей.

Через 20 дней после операции психоневрологическое состояние животных оценивалось в следующих тестах: удержание на вращающемся стержне, открытое поле, распознавание нового объекта и в тесте защитной реакции закапывания стеклянных шариков.

Тест удержания на вращающемся стержне, применяемый для оценки двигательно-координационных нарушений, проводился с использованием АПК «Ротарод+» (ООО «Нейроботикс», Россия) без предшествовавшего обучения животных. После трехкратного помещения на стержень вычислялись среднее время удержания и среднее пройденное расстояние для каждого животного.

Оценка двигательной активности проводилась в «норковой» модификации установки «Открытое поле» (квадрат, 80×80 см) в течение 5 мин для каждого животного. Подсчитывались следующие показатели: время, проведенное в центральной зоне, общее время неподвижности, количество переходов между квадратами поля (25 шт.), количество заглядываний в отверстия (16 шт.), количество вертикальных стоек и общая продолжительность груминга [5].

Тест распознавания нового объекта проводился на следующие сутки после габитуации животных в «Открытом поле». Данный тест основан на большей привлекательности новых объектов для грызунов и может отражать как когнитивный дефицит, так и тревожность животных, одним из компонентов которой выступает неофобия [6]. Эксперимент проходил в две сессии, разделенные 24-часовым интервалом, каждая сессия включала 10-минутные этапы ознакомления с объектами и распознавания нового объекта. Для фазы ознакомления подбирались пары одинаковых объектов, один из которых заменялся на кардинально новый (отличающийся по цвету, форме и текстуре) в фазе распознавания. Подсчитывались длительность исследования каждого из объектов и суммарная продолжительность исследования.

Тест закапывания стеклянных шариков представляет собой модель неофобии, тревоги и обсессивно-компульсивного поведения. При проведении данного теста животное помещают в пространство, полностью соответствующее их «домашней» клетке, однако некоторые элементы привычного окружения отсутствуют (запах, «соседи» и т. д.), а вместо них добавляются чужеродные объекты (стеклянные шарики). В результате животное вынуждено проявлять естественную защитную реакцию закапывания, обживая клетку [7]. Исследование проводилось через сутки после завершения теста распознавания нового объекта, при этом были использованы клетки типа Т/4, содержащие 5 см свежего подстилочного материала, поверх которого выкладывалось 40 стеклянных шариков диаметром 1,5 см, располагавшихся на расстоянии 4 см друг от друга. Исходный паттерн фотографировался, после чего в клетку помещалось тестируемое животное. Через 30 мин животное извлекали и фотографировали конечное состояние подстилки. При сравнении фотографий учитывалось количество закопанных более чем на 2/3 шариков, а также количество смещенных и нетронутых шариков (рис. 2).

Проведение всех поведенческих тестов сопровождалось видеорегистрацией при помощи веб-камеры и персонального компьютера, видеоматериалы анализировались после завершения тестов с помощью программы RealTimer (ООО НПК «Открытая Наука», Россия). Статистическая обработка производилась с помощью программ MS Excel («Microsoft», США), GraphPad Prism 5.0 («GraphPad Software Inc.», США) и Statistica 8.0 («StatSoft», США); проверка распределения на нормальность осуществлялась по критерию Колмогорова—Смирнова. При сравнении двух независимых групп данных различия оценивались с помощью t-критерия Стьюдента и критерия Манна—Уитни (при нормальном и отличающемся от нормального распределении соответственно). При сравнении большего количества групп данных, использовался одно- и многофакторный дисперсионный анализ с posthoc-тестом Ньюмена—Кеулса.

После моделирования стеноза велось пристальное наблюдение за общим состоянием животных (их подвижность, чистота шерстяного покрова, реакция на внешние раздражители, наличие симптомов неврологического дефицита), в ходе которого было обнаружено отсутствие видимых изменений психоневрологического статуса.

Через 20 дней после операции у животных со стенозом ОСА было обнаружено нарушение координации движений, что подтверждалось достоверным (p<0,05) сокращением расстояния, пройденного в тесте удержания на вращающемся стержне, на 50% по сравнению с контрольной группой (рис. 3, а). Также в опытной группе была выявлена тенденция (p=0,06) к сокращению общего времени удержания в данном тесте. Результат этого теста свидетельствует о наличии выраженного нарушения координации движений, проявляющегося в неспособности животных с редуцированным мозговым кровотоком удерживаться на вращающемся стержне на уровне интактных животных.

В «норковой» модификации теста «Открытое поле» у животных с экспериментальным стенозом ОСА было выявлено достоверное (p<0,05) снижение двигательной и исследовательской активности, не сопровождавшееся достоверным снижением времени нахождения в центре по сравнению с интактными животными (см. рис. 3, б). Оперированные животные с такой же скоростью, как и интактные, покидали центральную зону тестовой установки, но в дальнейшем их исследовательская и двигательная активности значительно снижались.

В двухсессионном тесте распознавания новых объектов достоверных различий между группами обнаружено не было, что может говорить об отсутствии нарушений кратковременной памяти в экспериментальной группе, однако это сопровождалось тенденцией к пониженной исследовательской активности на протяжении всего теста (см. рис. 3, в).

В тесте защитной реакции закапывания стеклянных шариков в контрольной группе отмечалось достоверное (p<0,001) превалирование количества закопанных шариков над количеством нетронутых (см. рис. 3, г). В группе с экспериментальной патологией, напротив, наблюдалось резкое угасание данной защитной реакции, что может быть связано с нарушением функционирования гиппокампа [7].

В ходе данного исследования было установлено, что через 20 дней после экспериментального моделирования стеноза ОСА у крыс в расширенной панели поведенческих тестов выявляются достоверные признаки психоневрологического дефицита, проявляющиеся нарушениями координации, снижением локомоторной активности, исследовательского и защитного поведения. Таким образом, данная модель может быть применена в исследованиях ХНМК, деменций сосудистого происхождения, а также в поиске фармакологических путей коррекции обнаруженного психоневрологического дефицита.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.