Активность системы комплемента у детей с расстройствами аутистического спектра

В современной литературе [1] имеются данные, свидетельствующие об участии асептического нейровоспаления и связанной с ним дисфункции иммунитета в патогенезе психических заболеваний, в том числе у детей при расстройствах аутистического спектра (РАС) [2, 3]. В качестве одного из маркеров, входящих в комплексную оценку, может служить уровень интегральной активности системы комплемента (СК). Считается, что этот показатель иммунного статуса больных с РАС может быть как диагностическим маркером [4, 5], так и мишенью терапевтического воздействия [6].

Существующие методы определения активности СК не позволяют использовать их в широкой медицинской практике, так как имеют либо очень высокую себестоимость [7], либо трудоемки и не слишком надежны (гемолитический метод оценки СК на эритроцитах барана). Поэтому нами был разработан новый метод оценки интегральной активности СК [8, 9]^​1​᠎.

Цель настоящего исследования — оценка активности СК у больных РАС и детской шизофренией на основе разработанного метода.

Разработка метода оценки общей активности СК и последующее обследование с его помощью здоровых и психически больных детей было проведено в лаборатории биохимии (руководитель — кандидат биологических наук О.С. Брусов) Научного центра психического здоровья.

Разработанный метод основан на реакции гибели простейших — инфузорий Tetrahymenapyriformis (штамм WH14 коллекции Всероссийского НИИ ветеринарной санитарии и экологии) в буферном растворе сыворотки крови (конечная концентрация сыворотки 5%). В качестве буфера использовали триэтаноламин («Лабтех»), титрованный концентрированной соляной кислотой («Sigma») до рН=7,5 и разведенный дистиллированной водой в 10 раз. Гибель инфузорий происходит вследствие активации СК сыворотки крови [8]: на мембранах клеток простейших образуются комплексы белков, представляющие собой сквозные поры, через которые вытекает цитоплазма, что приводит к лизису клеток простейших.

В режиме реального времени количество инфузорий подсчитывали с помощью автоматизированного прибора БиоЛаТ, разработанного нами специально для определения активности СК [9]. Он обеспечивает изображение на экране изменения количества живых клеток в режиме реального времени (график зависимости изменения числа тест-организмов от времени при воздействии СК)^​2​᠎.

Клиническое обследование больныхи диагностическую оценку их психического состояния проводили в отделении детской психиатрии (руководитель — доктор медицинских наук Н.В. Симашкова) Научного центра психического здоровья.

Клинико-лабораторный раздел работы был выполнен в два этапа.

На первом этапе (2013—2015) обследовали 249 больных детей с РАС и детской шизофренией в возрасте от 3 до 14 лет. В контрольную группу вошли 279 психически здоровых детей того же возраста.

На втором этапе было проведено сравнение значений Т₅₀ в двух диагностических группах больных. В первой группе были 57 пациентов с диагнозом детского психотического аутизма (F84.02 по МКБ-10). Этот тип аутизма характеризуется наличием аномального и/или нарушенного развития и проявляется в нарушении социального взаимодействия, общения и повторяющегося поведения. Во вторую группу были включены 34 случая детской шизофрении (F20.8 по МКБ-10). Это заболевание характеризуется специфическим возрастным своеобразием и полиморфизмом клинической картины, часто в раннем детстве возникает выраженный дефект олигофреноподобного типа. В состоянии этих детей преобладали кататонический и психопатоподобный синдромы, кроме того, во второй группе имелись также дети с олигофреноподобным дефектом. Все больные на момент исследований находились в остром психотическом состоянии.

Для детей с РАС отбор крови из локтевой вены является трудной задачей, поэтому была исследована взятая из пальца руки капиллярная кровь этих больных, а также детей контрольной группы. Исследования проводили в течение 2 лет (с 2014 г. до настоящего времени).

Общее количество исследований лимитировалось только поступлением проб крови при производительности метода 3 пробы за 120 мин.

Распределение полученных результатов в обеих группах не является нормальным, следовательно, для оценки достоверности отличия был использован непараметрический U-критерий Манна—Уитни (в соответствии с которым группа больных с РАС достоверно отличается от группы здоровых) (р=0,001).

В случае распределения данных, не являющегося нормальным, использовали непараметрические методы анализа распределения выборок: Median [Q1; Q3], т. е. значение медианы, 25% (Q1) и 75% (Q3) квартиля. Анализ различий между двумя выборками проводили с использованием непараметрического U-критерия Манна—Уитни. В случае нормального распределения данных использовали параметрические показатели распределения данных: Mean±SD, т. е. среднее значение ± стандартное отклонение. Анализ различий между двумя выборками проводили с использованием параметрического Т-теста для независимых переменных. Статистический анализ осуществляли с использованием программы Statistica, version 7 («StatSoft», США) и Analyse-it for Microsoft Excel (UK). Уровень p<0,05 принимали для оценки статистически значимых различий.

При анализе результатов у 112 (39%) детей с РАС показатель активности СК (увеличение значений T₅₀) оказался ниже ±95% доверительного интервала (±95%ДИ). T₅₀ для значений в контрольной группе (7,6—8,9) мин, у 103 (36%) детей — выше ±95%ДИ и у 72 (25%) — между нижними и высшими уровнями ±95%ДИ для контрольной группы.

Было также установлено, что распределение значений Т₅₀ для двух диагностических групп подчиняется нормальному закону распределения. Среднее для группы с детским психотическим аутизмом составило 9,92±2,57 мин, для группы с детской шизофренией — 8,37±2,37 мин. Для сравнения этих групп применили Т-тест для независимых переменных. Было показано их статистически значимое различие Т₅₀ (р=0,0065).

Мы предполагаем, что статистически значимое увеличение среднего значения для показателя Т₅₀ у детей с диагнозом «психотический аутизм» (F84.02 по МКБ-10) связано с истощением компонентов системы комплемента или их модификацией. Известно, что С4b-компонент комплемента у более чем 49% детей с аутизмом имеет «молчащий» аллель гена С4b [10], определяющего практически нулевую экспрессию компонента С4b, что приводит к снижению интегральной активности СК.

Исследования последних десятилетий [11] позволяют представить систему комплемента в качестве «сетевого» концентратора-организатора всей совокупности иммунологических и воспалительных процессов. Комплемент имеет перекрестные связи с гемостазом и фибринолизом, калликреин-кининовой и ренин-ангиотензиновой системами [12]. СК участвует в постнатальном созревании синапсов [13], клиренсе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), ангиогенезе [14], мобилизации гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток [15], регенерации тканей [16] и липидном обмене [17].

Поступающие в общий кровоток компоненты комплемента синтезируются в основном в гепатоцитах, частично моно-, адипо- и энтероцитах. Примерно 15% глобулинов плазмы составляют белки СК. В мозге их синтез происходит в клетках глии и нейронах [18]. Однако, поскольку в результате асептического нейровоспаления нарушается гематоэнцефалический барьер, то уровень активности СК в периферической крови может отражать и процессы, происходящие в ЦНС.

СК является каскадной протеолитической системой, механизм активации которой представлен тремя путями: классическим, альтернативным и лектиновым (рис. 1). Альтернативный путь обеспечивает минимальную постоянную активацию комплемента за счет спонтанного гидролиза центрального компонента комплемента — С3 и очень быстрое нарастание скорости активации за счет положительной обратной связи. При этом происходит массовое образование конечных продуктов активации СК — мембраноатакующих комплексов, которые обеспечивают тотальную гибель инфузорий Tetrahymenapyriformis. Этот процесс отражен на рис. 2 в виде падающего участка кривой выживания инфузорий, аппроксимируемого прямой линией, по уравнению которой вычисляется значение параметра Т₅₀ (мин).

Возможной причиной статистически достоверного снижения уровня Т₅₀ у больных с РАС может быть нарушение функций регуляторов этой системы. Оним из самых эффективных регуляторов СК является фактор I (FI) — эволюционно консервативная сериновая протеаза. Совместно с фактором H (FH) этот ингибитор альтернативного и классического путей в физиологических условиях контролирует интегральный уровень активации С.К. Изменения в ферментативной активности FI приводят к нарушению тонкого баланса между необходимой и чрезмерной активацией СК.

Этиология РАС до конца не изучена, но известно, что на развитие этой патологии влияют как генетические, так и иммунологические факторы, а FI комплемента может способствовать нарушению регуляции иммунного ответа. Ранее было установлено [19, 20], что аномальная активность этого фактора отмечается у детей с РАС. В результате как повышенного, так и пониженного уровня активности FI общий уровень активации СК может быть снижен. В первом случае речь может идти об излишнем ингибировании СК [19], во втором — об излишнем расходовании ее компонентов в результате аномального «раскручивания» положительной обратной связи альтернативного пути c последующим их истощением в крови [20]. В связи с этим заметим, что в патогенезе психических заболеваний существенное значение имеет активация СК, которая связана с асептическим нейровоспалением и соответственно чрезмерным расходованием белков СК [21—23]. Поэтому в этих случаях более приемлемым является объяснение снижения уровня интегральной активности СК в подгруппе больных детей (39% от общего количества) повышением расходования ее компонентов в результате нейровоспаления.

Для детального выявления причин нарушения состояния СК необходимо изучение экспрессии ее основных белков и исследование концентрации в крови компонентов этой системы. Аргументом для обязательного изучения генетического полиморфизма основных белков комплемента у больных с РАС со сниженным уровнем активности СК может служить выявленный нами очень низкий уровень интегральной активности СК (в 2—3 раза по сравнению с нормой) у 3 детей из одной семьи с генетически подтвержденным синдромом Мартина—Белла: у больного мальчика 8 лет Т₅₀ составило 19,5 мин, у его 5-летнего брата — 38,8 мин, у сестры (1,7 года) — 33 мин при средней норме, равной 7,6—8,9 мин.

На основе полученных в настоящем исследовании данных могут быть сделаны следующие выводы: 1) разработанный метод интегральной оценки активности СК по реакции гибели Tetrahymenapyriformisс помощью прибора БиоЛаТ позволяет быстро и эффективно (3 пробы за 120 мин) получать общую оценку активности СК; 2) сравнительная оценка общей активности СК по показателю Т₅₀ для детей с РАС и здоровых позволяет выявить статистически достоверные различия на уровне р<0,005; 3) установлено статистически значимое уменьшение интегральной активности СК у детей с диагнозом психотического детского аутизма по сравнению с детьми, больными шизофренией; 4) исследование общей активности СК может служить дополнительным диагностическим маркером для дифференцированной диагностики РАС в детском возрасте.