Влияние таурина на окислительные процессы при отеке головного мозга

Отек и набухание головного мозга — одна из ключевых проблем современной нейрохимии. В клинической практике отек мозга является одним из ведущих патологических синдромов при разных заболеваниях (гипертонические кризы, черепно-мозговая травма, опухоли, интоксикации и т. д.). Под отеком понимают патологическое накопление жидкости в тканях и межклеточных пространствах, наступающее вследствие нарушения баланса между кровью и тканями. При увеличении объема мозга в ограниченном внутричерепном пространстве происходит его сдавление, вследствие чего нарушается кровообращение, приводящее к ишемии мозга [1]. Происходит нарушение энергетического обмена и связанное с этим понижение уровня активности АТФ-зависимых ферментов, в частности Nа⁺, К⁺-АТФаз, ответственныx за поддержание мембранного потенциала клетки, а также инициация процессов свободнорадикального окисления липидов и белков, приводящих к развитию окислительного стресса [2]. Развитие окислительного стресса связано с накоплением активных форм кислорода (АФК), которые оказывают повреждающее действие на структуру мембран клетки. Развивается окисление SH-групп цистеина или метионина в белках. Атомы металлов переменной валентности имеют на внутренних атомных орбиталях непрочно связанные электроны и являются объектом атаки АФК, которые стремятся захватить либо отдать электрон, что приводит к изменению редокс-состояния тиоловых групп в белках [3].

Одним из основных антиоксидантных механизмов, защищающих от повреждающего действия АФК, является восстановительный потенциал системы глутатиона (GSH), который определяет редокс-состояние в клетке и влияет на эффективность ее функционирования. GSH выступает акцептором АФК, ко-фактором ряда ферментов антиоксидантной и детоксикационной систем [4], участвует в экспрессии редоксчувствительных генов, регуляции внутриклеточной сигнализации [5].

Цель настоящего исследования — изучение свободнорадикального окисления липидов, окислительной модификации белка, активности глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы, а также конечного продукта оксида азота — нитрита в митохондриальной фракции головного мозга животных во время экспериментально вызванного отека мозга при лечении таурином.

Исследование проводили на беспородных белых крысах массой 170—200 г, содержащихся в соответствии с правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (Страсбург, 1986 г.). Токсический отек головного мозга вызывали внутрибрюшинным введением тетраэтилолова в дозе 10 мг на 1 кг массы животного. Критерием развития отека мозга служили выраженная гидратация мозговой ткани и показатели электронно-микроскопического исследования [6]. О содержании воды судили по сухому остатку ткани мозга после высушивания при 110 °C до постоянной массы.

Животные были распределены на три группы по 15 в каждой: 1) интактные; 2) с воспроизведенным отеком мозга; 3) с воспроизведенным отеком мозга, получавшие таурин в дозе 50 мг/кг внутрибрюшинно ежедневно в течение 5 дней.

Митохондрии головного мозга выделяли в среде, содержащей 0,25 М сахарозы и 0,01 М трис-НС1 буфера, рН 7,4, методом дифференциального центрифугирования при 13 000 g, после осаждения ядер при 600 g.

Об активности перекисного окисления липидов судили по количеству образования гидроперекисей липидов и малонового диальдегида (МДА). Гидроперекиси липидов определяли по цветной реакции с тиоцианатом аммония при максимуме поглощения 480 нм [7]. МДА определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой [8]. Количество белка определяли по Лоури [9].

Для определения окислительной модификации белков в головном мозге использовали метод Е.Е. Дубининой и соавт. [10]. Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгидразонов регистрировали при длинах волн 356 и 370 нм (альдегидные и кетонные продукты окислительной модификации нейтрального характера), а также 430 и 530 нм (основной характер). Степень окислительной модификации белков выражали в единицах оптической плотности, соотнесенных с 1 мг ткани, используя коэффициент молярной экстинкции 22·10³ М^–1см [10].

Конечный продукт оксида азота нитрит определяли с помощью реактива Грейса (1% сульфаниламида, 0,1% нафтилендиамина, 2,5% фосфорной кислоты), абсорбцию раствора измеряли при длине волны 546 нм. В качестве стандарта использовали нитрит натрия [11].

Активность глутатионпероксидазы определяли по реакции восстановления перекиси водорода (Н2О2) и гидроперекисей липидов (ROOH) в присутствии GSH [12]. Активность глутатионредуктазы определяли спектрофотометрически по приросту НАДФН [13]. Результаты обрабатывали статистически по t-критерию Стьюдента.

Было обнаружено увеличение содержания гидроперекисей липидов и МДА в митохондриальной фракции головного мозга (см. таблицу). При отеке мозга вследствие нарушения доставки кислорода в ткань понижается концентрация молекулярного кислорода и увеличивается уровень восстановленности компонентов дыxательной цепи, в результате чего стимулируется восстановление кислорода по одноэлектронному пути, приводящему к образованию супероксидного радикала, дающего начало другим активным формам кислорода (синглетный кислород, гидроперекиси). Показано, что двумя основными местами образования свободных радикалов в дыхательной цепи являются комплексы 1 (НАДН-коэнзим-Q-редуктаза) и 2 (убихинон-цитохром с-редуктаза) [14]. Увеличению содержания перекисей липидов в митохондриальной фракции головного мозга способствует высокое содержание легкоокисляемых субстратов, таких как полиненасыщенные жирные кислоты, а также наличие негеминового железа, являющегося активатором перекисного окисления липидов. В этих условиях митоxондриальная цепь переноса электронов становится мощным источником образования АФК — нестабильныx и крайне реактивныx метаболитов.

АФК вызывают окислительную модификацию белков, в результате чего усугубляются мембранные повреждения. Считают [10], что в состоянии окислительного стресса атаке АФК подвергаются в первую очередь не липиды, а белки мембран.

Анализ полученных данных показал (см. рисунок), что у животных с моделированным отеком мозга уровень карбонильных групп в митохондриальной фракции головного мозга значительно выше, чем у интактных животных. Это свидетельствует о возрастании окислительного повреждения белков при отеке мозга.

Фактически все аминокислотные остатки белков способны к окислению, что ведет к изменению их функций. Окислению подвергаются сульфо- и аминогидроксильные группы аминокислот, что приводит к образованию поперечных сшивок между белками или между белком и другой молекулой, содержащей NН2-группу. Наиболее распространенным пусковым механизмом окислительного повреждения мембранных белков является реакция сульфгидрильных (SH) групп аминокислоты цистеин со свободными радикалами. При этом образуются радикалы с локализацией неспаренного электрона около атома серы (-S•), которые затем взаимодействуют друг с другом с образованием дисульфидов. Результатом окисления аминокислот может быть нарушение вторичной и третичной структуры белков, облегчающее дальнейшее окисление аминокислотных остатков, и денатурация белковых молекул, в результате чего нарушаются их функции, в частности инактивируются ферменты [15].

Нарушение нормального функционирования митохондриальной цепи переноса электронов способствует также активированию образования оксида азота. Исследование содержания оксида азота обнаружило увеличение его содержания в головном мозге животных с экспериментальным отеком мозга. При взаимодействии оксида азота (NO) с супероксид-анионом образуются активные соединения нитрозоний (NO+), нитроксил (NO–) и пероксинитрит (ONOO–). Пероксинитрит обладает гораздо большей реакционной способностью, чем NO и супероксидный радикал, его токсический эффект проявляется в ингибировании митохондриальных ферментов, что приводит к снижению выработки АТФ. При повышенных концентрациях NO (>1мкМ) взаимодействует с комплексами дыхательной цепи (цитохромоксидаза, убихинон), приводя к угнетению синтеза аденозинтрифосфата [16].

Процессы свободнорадикального окисления в организме контролируются антиоксидантной системой. Ведущая роль в поддержании антиоксидантного статуса клетки принадлежит глутатионпероксидазе и глутатионредуктазе. Основной функцией данных ферментов является восстановление гидроперекисей до спиртов. Как показали результаты исследования, при отеке мозга наблюдается понижение содержания глутатиона и активности глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы (см. таблицу).

Особое значение имеет определение содержания глутатиона в головном мозге животных при его отеке. В организме животных и человека глутатион присутствует как в окисленной (GSSG; около 10% от общего количества), так и восстановленной (GSH) форме. Основной антиоксидантный эффект глутатиона реализуется посредством его участия в работе ферментативных антиоксидантов; будучи субстратом для глутатионпероксидаз, он фактически выступает донором атомов водорода для восстановления Н2О2 и липидных перекисей.

В связи с тем, что снижение уровня глутатиона и антиоксидантных ферментов является одним из ведущих факторов в развитии различных патологических процессов большой интерес вызывают препараты, повышающие содержание глутатиона и активирующие глутатионзависимые реакции. В качестве лечебного препарата нами была применена аминокислота таурин. Существуют достаточно убедительные данные, демонстрирующие роль таурина как активного осморегулятора, что особенно важно для нейронов головного мозга. Показана корреляция между содержанием в ткани мозга воды и таурина [17]. При печеночной энцефалопатии снижение содержания таурина в ЦНС может быть одной из причин отека мозга. Он также участвует в качестве нейромодулятора в процессах контроля дыхательной функции, особенно при острой гипоксии [18].

Как показали результаты наших исследований, введение таурина в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг приводило к уменьшению содержания продуктов перекисного окисления липидов, нормализации окислительной модификации белков в митохондриальной фракции головного мозга крыс с отеком мозга (см. таблицу).

После проведенного лечения уровень изучаемых показателей приблизился к показателям, полученным в контроле (см. таблицу), с достоверными изменениями в содержании как начальных, так и конечных продуктов перекисного окисления липидов. Под влиянием таурина статистически достоверно снижалось также содержание окисленных белков в митохондриальной фракции головного мозга крыс с отеком мозга.

Таким образом, можно сделать вывод, что введение таурина крысам с экспериментальным отеком мозга приводит к нормализации окислительных процессов в митохондриальной фракции головного мозга крыс.