Окислительные процессы и обмен липидов при экспериментальном паркинсоническом синдроме

Болезнь Паркинсона (БП) - хроническое нейродегенеративное заболевание, сопровождающееся прогрессирующей гибелью дофаминергических нейронов в головном мозге, резким снижением концентрации нейромедиатора дофамина в полосатом теле и накоплением внутриклеточных включений в нейронах (тельца Леви), главным компонентом которых является белок α-синуклеин. Одной из причин поражения нейронов при БП считают окислительный стресс [7, 13]. В результате окисления дофамина при участии моноаминооксидазы В образуется супероксидный радикал, обусловливающий развитие окислительного стресса [12, 15] с нарушением равновесия между прооксидантной и антиоксидантной системами. Известно, что при старении уменьшается продукция основных антиоксидантных ферментов, в результате чего увеличивается чувствительность к оксидантному стрессу [4], что может быть одной из причин возрастного снижения резистентности дофаминергических нигростриатных нейронов к пропаркинсоническим факторам. Таким образом, одним из перспективныx направлений в лечении БП является антиоксидантная терапия [5, 10], особенно в начальной стадии развития болезни.

Целью исследования явилось изучение процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ), а также определение содержания фосфолипидов (ФЛ), галактозилцерамидов (ГалЦер), сульфогалактозилцерамидов (СГалЦер) и продукта их гидролитического расщепления - сфингозина в головном мозге животных с экспериментально вызванным паркинсоническим синдромом (ПС) и при введении нового синтезированного нами препарата. В структуру исследуемого вещества входят литий и аминокислота цистеин^[1]. Препараты лития применяют при различныx нейродегенеративныx заболеванияx. Ионы лития повышают чувствительность нейронов гиппокампа и других областей мозга к действию дофамина. Литий конкурирует с ионами натрия, участвуя в регуляции работы кальциевых каналов в митохондриях, а также снижает активацию апоптозного каскада [11]. Цистеин оказывает выраженное антиоксидантное действие и является источником серы, инактивирующим свободные радикалы. Его рекомендуют применять при синдроме хронической усталости, рассеянном склерозе, БП и болезни Альцгеймера.

Эксперименты проводили на беспородных белых старых крысах (возраст 2-2,5 года), содержащихся в условиях вивария. Модель экспериментального ПС осуществляли ежедневным внутрибрюшинным введением МФТП (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрапиридин) в дозе 25 мг/кг в течение 6 дней. Поведенческие характеристики (координация движений, тремор, ригидность мышц, олигокинезия) служили критерием развития болезни. Животные были распределены на 3 группы по 10 животных в каждой: 1-я - интактные; 2-я - животные с воспроизведенным ПС; 3-я - животные с воспроизведенным ПС, получавшие исследуемый препарат в дозе 20 мг/кг. Исследуемое вещество вводили с 6-го по 12-й дни эксперимента, через 1 ч после введения МФТП. Животных забивали на 12-й день эксперимента через 1 ч после введения препарата.

Об активности ПОЛ судили по количеству образования гидроперекисей (ГП) и малонового диальдегида (МДА). ГП определяли по цветной реакции с тиоционатом аммония при максимуме поглощения 480 нм [9]; МДА - по реакции с тиобарбитуровой кислотой [2]; количество белка - по Лоури [14].

Экстракцию липидов осуществляли по методу Фолча. Фракционирование индивидуальных фосфолипидов проводили методом одномерной хроматографии в тонком слое силикагеля («Мерк», Германия) в системе растворителей хлороформ:метанол:аммиак в соотношении (65:35:5). Минерализацию липидного фосфора осуществляли в среде серной и азотной кислот с последующим расчетом количества неорганического фосфора в мкг влажной ткани [6].

Выделение осадка ГалЦер и СГалЦер основано на их способности образовывать плотный белый слой на границе хлороформенного и водного слоев при обработке хлороформенно-метанолового экстракта липидов трихлоруксусной кислотой и водой. Фракционирование суммарных ГалЦер и СГалЦер проводили методом тонкослойной хроматографии (пластины «Мерк», Германия) в системе растворителей хлороформ-метанол-концентрированный аммиак (80:20:0,4). Количество ГалЦер определяли по углеводному компоненту с резорцином, а СГалЦер - по сульфатной группе в реакции с азуром [8].

Для выделения сфингозиновых оснований смесь ГалЦер и СГалЦер подвергали кислотному метанолизу смесью Н₂SO₄-метанол (1:20) при температуре 78-80°C в течение 6 ч, с последующей экстракцией сфингозиновых оснований диэтиловым эфиром. Количество сфингозина определяли цветной реакцией с метилоранжем при длине волны 415 нм [8].

Статистическую значимость различий оценивали методом Стьюдента.

В головном мозге интактных животныx обнаружен определенный стационарный уровень интенсивности свободнорадикальных реакций; развитие ПС сопровождалось активированием процесса ПОЛ, что выражалось в увеличении содержания ГП и МДА (см. рисунок).

Было проведено изучение влияния синтезированного антиоксидантного препарата на ПОЛ в головном мозге животных с экспериментальным ПС. Введение исследуемого вещества животным с экспериментальным ПС приводит к нормализации количества перекисей, приближая их к показателям контрольных животных, что является доказательством способности препарата оказывать антиоксидантное действие (см. рисунок).

Механизм нейропротекторного действия использованного нами вещества связан с тем, что в его структуру входит цистеин, который принимает участие в синтезе глутатиона. Глутатион - трипептид, образованный аминокислотами цистеином, глутаминовой кислотой и глицином. Его основной антиоксидантный эффект реализуется посредством участия в работе антиоксидантных ферментов глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы. Глутатион, как и другие SН-содержащие белки, является акцептором активных форм кислорода и тем самым ингибирует свободнорадикальное окисление. Снижение содержания глутатиона приводит к повышению чувствительности митохондрий к окислительному стрессу.

Активные формы кислорода, вызывая ПОЛ, могут быть токсичными как для нейронов, так и олигодендроцитов, образующих миелин. Высокое содержание в головном мозге липидов и уникальность их структуры определяет характер развития в них ПОЛ. Известно, что изменение состава липидов в мембране клеток, наряду с метаболическими изменениями, чаще всего бывает вызвано процессами свободнорадикального окисления. Изучение спектра ФЛ в мозговой ткани при экспериментальном ПС (табл. 1) позволило обнаружить увеличение содержания лизофосфатидилхолина (ЛФ ) при уменьшении содержания фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилсерина (ФС) и фосфатидилэтаноламина (ФЭ).

Известно, что для БП характерно понижение митохондриального комплекса 1 в дофаминергических нигростриатных нейронах. При посмертном гистологическом исследовании мозга больных было обнаружено снижение активности фермента NАДФН-убихинон-оксидоредуктазы [7]. Уменьшение активности фермента вызывает нарушение работы нейрональных митохондрий и снижение продукции АТФ и, как следствие, понижение активности АТФ-зависимых ферментов, в частности Nа-, К-АТФаз. В результе происходит деполяризация мембраны клеток, усиливаются интенсивность ионных потоков через мембрану и массированное поступление Са²⁺ в нейрон, запускающее весь каскад внутриклеточных нейродегенеративных реакций, нарушается также работа Са-насоса, откачивающего Са²⁺ из клетки. Образование активных форм кислорода и увеличение ионов Са²⁺ в митохондриях также приводит к активации фосфолипаз, отщепляющих жирные кислоты во втором положении молекулы ФЛ. Наблюдаемое уменьшение содержания ФХ, ФС, ФЭ при параллельном увеличении содержания ЛФХ, вероятно, связано с повышением активности фосфолипаз при развитии ПС.

Исследование нейтральных гликолипидов позволило обнаружить в головном мозге интактных животных 2 фракции ГалЦер и 2 фракции СГалЦер, различающиеся между собой содержанием жирных кислот (табл. 2).

Особый интерес вызывает уменьшение содержания сфингомиелина в головном мозге животных при экспериментальном ПС, так как обнаружено одновременное увеличение содержания сфингозина (см. табл. 1, 2). ГалЦер может быть источником церамида и сфингозина наряду со сфингомиелином. Сфингозин участвует в регуляции пролиферации и гибели клеток в связи со способностью ингибировать активность протеинкиназы С [1]. Церамиды и сфингозин являются медиаторами апоптоза и образуются внутриклеточно как продукты катаболизма сфингомиелина (сфингомиелин/сфингомиелиназный механизм) и/или расщеплением галактозил-глюкозилцерамида (галакозилцерамид/глюкозидазный механизм) лизосомальными и цитоплазматическими гидролазами. Полученные результаты позволяют заключить, что при ПС имеет место ферментативное расщепление нейтральных гликолипидов и сфингомиелина, что, вероятно, связано с повышением активности ферментов, приводящих к накоплению сфингозина. Принимая во внимание, что указанные ферменты являются мембранозависимыми и зависят от уровня окислительных процессов в клетке, нами было проведено исследование с введением антиоксидантного препарата.

Изучение количественного состава фосфолипидов, нейтральных гликолипидов и сфингозина при введении препарата позволило обнаружить частичную нормализацию количества указанных гликолипидов (см. табл. 1, 2). Протекторное действие препарата связано с сохранением качественного и количественного содержания липидов клеточных мембран, обусловливающего нормальное течение таких метаболических реакций, как проницаемость, ионный транспорт, активность липидсвязанных ферментов и др. Анализ полученных данных позволил сделать вывод о том, что использованный нами препарат обладает антиоксидантным действием и уменьшает образование перекисей липидов. Нам представляется, что синтезированный препарат может быть эффективен при различных патологических состояниях, характеризующихся нарушением окислительных процессов и в связи с этим представляет определенный научно-практический интерес.