Цитокиновая сигнализация важна для аутокринной регуляции клеточной активности, поскольку она обеспечивает условия для межклеточного взаимодействия. При этом ответ клеточной системы на информационные сигналы, опосредуемые цитокинами, в значительной мере определяется состоянием JAK/STAT-сигнального пути [1—4]. В этом сигнальном пути связывание цитокина с соответствующим рецептором запускает механизм активации рецепторной протеинкиназы (JAK), фосфорилирующей цитоплазматические белки (STAT), образующие ядерные транскрипционные факторы [2, 4]. В качестве негативных регуляторов данного сигнального пути выступают белки, дефосфорилирующие JAK-киназы (SOCS-белки), а также протеины семейства PIAS, прерывающие проведение рецепторного сигнала внутрь клетки [5]. При этом SOCS-белки, в частности SOCS2, обеспечивают регуляцию как адаптивных иммунных реакций, регулируя дифференцировку и пролиферацию Т-хелперов, так и врожденных иммунных механизмов, ограничивая провоспалительную активацию антигенпрезентирующих клеток, а также натуральных киллеров (NK) [6—9].

Таким образом, состояние JAK/STAT-сигнального пути определяет эффективность процессов пролиферации, дифференцировки, роста, противовирусного ответа и т. д. Воздействие неблагоприятных экологических факторов зачастую сопровождается нарушением согласованного функционирования внутриклеточных молекулярных процессов, при котором наблюдается снижение их эффективности. Это создает предпосылки нарушения нормального клеточного функционирования, снижения клеточной резистентности, изменения реактивности, а также способствует преждевременной клеточной гибели. Перенесенная патология часто сопровождается нарушением функционирования внутриклеточных молекулярных процессов, затрудняя саногенез и регенерацию, что способствует хроническому течению и злокачественной трансформации.

В условиях воздействия на организм неблагоприятных факторов внешней среды особую значимость приобретает задача восстановления оптимального функционирования внутриклеточных молекулярных систем, в том числе путем восстановления естественных для живой системы молекулярно-волновых параметров водосодержащих сред, как первичной мишени воздействия ксенобиотиков [10, 11]. Решение этой проблемы зависит от поиска новых лечебных факторов, способных компенсировать отклонения внутриклеточного метаболизма.

Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют об иммуномодулирующем действии низкоинтенсивного электромагнитного излучения в широком диапазоне частот сверхвысокочастотного (СВЧ) и крайневысокочастотного излучения [11—13]. Вместе с тем молекулярные внутриклеточные механизмы биологических эффектов данного физиотерапевтического фактора изучены недостаточно [12, 14].

Цель настоящего исследования — изучение биологических эффектов низкоинтенсивного СВЧ-излучения на состояние JAK/STAT-сигнального пути в мононуклеарных лейкоцитах периферической крови реконвалесцентов внебольничной пневмонии (ВП).

В соответствии с целью настоящей работы были обследованы 30 пациентов мужского пола с бактериальной ВП нетяжелого течения в стадии реконвалесценции (15—17-е сутки) в возрасте от 20 до 35 лет (основная группа). Контрольную группу составили 15 практически здоровых молодых человек из числа доноров крови в возрасте от 20 до 33 лет. Материалом для исследования служила венозная кровь, забиравшаяся в утренние часы (с 7:00 до 7:30) из локтевой вены. Путем разделения пробы крови на две части в каждой группе формировали две подгруппы. Первая подгруппа включала необлученные образцы крови, 2-я — образцы, подвергнутые СВЧ-облучению при плотности потока мощности 0,1 мкВт/см².

Исследование эффектов СВЧ-облучения проводили с использованием набора реагентов Цитокин-Стимул-Бест (ЗАО «Вектор Бест», г. Новосибирск). Для проведения исследования 1 мл цельной крови вносили во флакон, содержащий 4 мл среды DMEM. Подготовленные таким образом образцы облучали в течение 45 мин аппаратом микроволновой терапии Акватон-02 (ООО «Телемак», Саратов) с частотой 1000±0,01 МГц (плотность потока энергии 50 нВт/см²). После облучения флаконы помещали на 24 ч в термостат при температуре 37 ^°С с последующим выделением мононуклеаров в градиенте плотности фиколл-верографина (ρ=1,077) и приготовлением лизатов по методике, рекомендованной производителем тест-систем для иммуноферментного анализа (ИФА). Для приготовления лизатов использовали 1 мл клеточной суспензии, содержащей 5×10⁶ клеток. Подсчет клеток и анализ их жизнеспособности производили с использованием автоматического счетчика клеток TC20 («Biorad», США).

Внутриклеточный уровень общих форм киназ JAK1, JAK2 и JAK3, белков SOCS2, SOCS4, SOCS7, PIAS3, фосфорилированной по тирозину в положении 701 формы STAT1, в положении 705 формы STAT3, в положении 693 формы STAT4, в положении 694 формы STAT5B, в положении 641 формы STAT6 оценивали методом ИФА. При проведении исследований использовали соответствующие наборы CUSABIO BIOTECH (Китай). ИФА проводился на анализаторе Personal LAB («Adaltis Italia S.p.A.», Италия).

Статистическую обработку проводили с помощью программы Statistica 7.0. Статистическую значимость (р) межгрупповых различий для независимых выборок оценивали с помощью U-критерия Манна—Уитни, в случае парных сравнений использовали Т-критерий Вилкоксона.

Результаты оценки внутриклеточной концентрации исследуемых факторов у практически здоровых лиц и реконвалесцентов ВП представлены в табл. 1.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что культуры клеток реконвалесцентов ВП характеризуются максимальными различиями c культурами здоровых лиц по уровню STAT5B, JAK3, SOCS2 и PIAS3. При этом в группе контроля уровень STAT3, STAT4 и JAK1 выше, чем у реконвалесцентов В.П. Указанные обстоятельства свидетельствуют о сохранении у реконвалесцентов ВП молекулярных проявлений воспалительной реактивности [4, 13].

Анализ внутриклеточного содержания отдельных компонентов JAK/STAT-сигнальной системы указывает на преобладание среди всех исследованных компонентов внутриклеточной концентрации протеинкиназы JAK1. Ее уровень в мононуклеарах практически здоровых лиц в 2,19 раза (р=0,022) превышал концентрацию протеинкиназы JAK3, и в 10 раз — концентрацию JAK2 (р=0,00011). У реконвалесцентов ВП соответствующее превышение составляло 2 (р=0,022) и 9,75 (р=0,001) раза соответственно.

Из числа исследованных белков STAT наибольшим внутриклеточным содержанием в группе контроля отличается STAT6, наименьшим — STAT5B. При этом в мононуклеарах практически здоровых лиц концентрация STAT6 превышает уровень STAT3 в 1,49 раза (р=0,027), STAT1 — в 1,92 раза (р=0,021), STAT4 — в 2,19 раза (р=0,011), а STAT5B —в 3,3 раза (р=0,0022).

В мононуклеарах реконвалесцентов ВП концентрация STAT6, также как и у здоровых лиц, преобладает над другими STAT-белками. В данной группе уровень STAT6 превышал концентрацию STAT3 в 1,8 раза (р=0,027), STAT1 — в 1,86 раза (р=0,03), STAT5B — в 1,9 раза (р=0,02), а STAT4 — в 2,6 раза (р=0,0035).

Анализ полученных результатов свидетельствует о повышенном (8,0%) уровне киназы JAK3 (p < 0,05) у реконвалесцентов В.П. Кроме того, у таких пациентов отмечено повышение содержания белка STAT5B на 81,7% (p<0,005), а SOCS2 и PIAS3 — на 16,1% (p<0,001) и 72,7% (p<0,001) соответственно. На этом фоне наблюдалась тенденция к снижению внутриклеточной концентрации JAK2 на 0,4% (p<0,05), STAT3 — на 13,4% (p>0,1), STAT4 — на 10,3% (p>0,1).

Таким образом, в агранулоцитах цельной крови реконвалесцентов ВП имеет место активация сигнального пути, опосредуемого JAK3/STAT6/STAT5B, способствующая повышению эффективности рецепторной трансдукции сигналов от рецепторов интерлейкина-2, -4, -7, -9, -15 и -21 (семейства цитокинов, передающих сигнал посредством рецепторов с общей γ-цепью), определяющей изменение функционального состояния Т-, В- и NK-клеток. Существенное повышение у реконвалесцентов ВП внутриклеточного уровня STAT6, снижение активности STAT3 и STAT4, являющихся эссенциальными факторами дифференцировки Т-хелперов 1-го и 17-го типов, а также повышенный уровень ингибитора STAT3 — белка PIAS3 и супрессора цитокиновой сигнализации SOCS2 определяют формирование у реконвалесцентов ВП поляризации иммунного ответа по гуморальному типу с ограничением клеточно-опосредованной цитотоксичности и активности фагоцитоза.

Особенности биологических эффектов низкоинтенсивного СВЧ-облучения образцов цельной крови практически здоровых лиц и реконвалесцентов ВП представлены в табл. 2, 3.

Анализ биологических эффектов СВЧ-излучения культуры клеток крови здоровых лиц выявил его негативное влияние на уровень фосфорилированных форм STAT-факторов, максимально в отношении STAT5B. Отмечалось также снижение концентрации SOCS-белков, более выраженное в отношении SOCS7. На этом фоне в облученных культурах увеличилось содержание белков JAK и PIAS3.

Проведенный анализ биологических эффектов низкоинтенсивного СВЧ-облучения цельной крови реконвалесцентов ВП свидетельствует о снижении функциональной активности STAT-факторов под влиянием облучения. Наибольшее его влияние отмечается в отношении STAT4, уровень которого в облученных культурах в сравнении с контрольными образцами снизился на 75,5‰.

Таким образом, низкоинтенсивное СВЧ-облучение культуры клеток крови реконвалесцентов ВП в большой мере способствует снижению доли активных форм STAT-белков, входящих в состав транскрипционных факторов. При этом СВЧ-излучение способствует нормализации уровней STAT1 и STAT6, а также приближению уровня STAT5B к значениям здоровых лиц. Вместе с тем данное воздействие сопровождается дальнейшим снижением внутриклеточной концентрации фосфоформ STAT3 и STAT4, уровень которых у реконвалесцентов ВП после облучения в сравнении с исходным уровнем в группе контроля снизился на 19,6% (p<0,05) и 16,1% (p<0,05) соответственно.

Облучение культуры клеток цельной крови реконвалесцентов ВП способствует приближению внутриклеточной концентрации STAT5B к его уровню у практически здоровых лиц на 15,5%, JAK1 — на 27,3%, SOCS2 —на 2,2%, SOCS4 — на 3,9%, SOCS7 — на 4,7%. Уровни STAT1 и STAT6 под влиянием облучения культур клеток цельной крови реконвалесцентов ВП приближались к уровню необлученных образцов группы контроля на 93,6 и 90,0% соответственно, что практически соответствует уровню здоровых лиц. Характер наблюдаемых биологических эффектов облучения позволяет говорить о тенденции к нормализации внутриклеточной концентрации исследованных факторов в мононуклеарах реконвалесцентов ВП под воздействием излучения.

Приближение концентрации исследованных факторов к уровню практически здоровых лиц, в частности STAT6, создает условия для нормализации реактивности Т-хелперов 2-го типа, а нормализация уровня STAT1, регулирующего экспрессию генов интерферонов I и II типа, способствует также восстановлению реактивности цитотоксических клеток [15—17]. Динамика внутриклеточного содержания STAT5B говорит о тенденции к нормализации у реконвалесцентов ВП под влиянием облучения и пролиферативной активации гемопоэтических клеток [4, 16].

Однократное низкоинтенсивное СВЧ-воздействие на культуру клеток цельной крови способствует усилению различий между здоровыми лицами и реконвалесцентами ВП по внутриклеточному содержанию отдельных факторов. Так, под влиянием облучения в группе реконвалесцентов ВП отмечено более выраженное, чем в контроле, снижение факторов STAT3 и STAT4 (44,8 и 74,0% соответственно). Таким образом, у реконвалесцентов ВП в сравнении с практически здоровыми лицами облучение приводило к более выраженному дефосфорилированию STAT4, эссенциального фактора дифференцировки Т-хелперов 1-го типа, обеспечивающего экспрессию генов интерферона-γ, фактора некроза опухоли-α, а также генов цитокиновых рецепторов, в частности интерлейкина-12 и -18 [17—19]. В сравнении с предыдущим фактором СВЧ-облучение в меньшей степени снижает концентрацию STAT3, являющегося одним из эссенциальных факторов дифференцировки T-хелперов 17-го типа [19]. Вместе с тем уровень селективного ингибитора активности STAT3 — протеина PIAS3 под влиянием облучения в культуре клеток реконвалесцентов ВП в сравнении со здоровыми лицами возрос на 60%, определяя угнетение активности STAT3 и снижение экспрессии контролируемых им генов [2, 3, 5, 19].

В облученных культурах реконвалесцентов ВП в сравнении со здоровыми лицами уровень JAK2 и JAK3 был повышен на 45,5 и 3,2% соответственно. Таким образом, изучаемое физическое воздействие способствует повышению эффективности передачи рецепторного сигнала от молекулы цитокинов и факторов роста внутрь клетки.

Выявлена тенденция к снижению в облученных культурах реконвалесцентов ВП внутриклеточной концентрации супрессоров цитокиновой сигнализации до уровня здоровых лиц. Повышение внутриклеточного уровня в мононуклеарах обследованных пациентов белка SOCS2, а также других изучаемых факторов JAK/STAT-сигнального пути определяет сохранение у реконвалесцентов ВП высокой реактивности мононуклеаров цельной крови. Снижение внутриклеточной концентрации SOCS-белков в облученных культурах свидетельствует об иммуномодулирующем действии низкоинтенсивного СВЧ-излучения, приводящем к снижению клеточной реактивности и приближению ее к уровню здоровых лиц [4, 19].

1. Фаза реконвалесценции патологических изменений у больных ВП протекает на фоне измененной функциональной активности JAK/STAT-сигнального пути, проявляющейся статистически значимым повышением внутриклеточного содержания в мононуклеарах цельной крови JAK3, STAT5B, SOCS2, а также тенденцией к снижению уровня STAT3, STAT4 и JAK1.

2. Однократное облучение культуры клеток цельной крови реконвалесцентов ВП излучением частотой 1000 МГц, плотностью потока мощности 50 нВт/см² сопровождается нормализацией концентрации в мононуклеарах STAT1 и STAT6, приближением к уровню здоровых лиц внутриклеточного содержания фосфорилированной по тирозину в положении 694 формы STAT5B, JAK1, SOCS2, SOCS4 и SOCS7. Под влиянием облучения у больных ВП отмечено снижение концентрации фосфорилированных по тирозину в положении 705 и 693 форм STAT3 и STAT4 соответственно и повышение концентрации протеина PIAS3.

3. Установлено иммуномодулирующее действие низкоинтенсивного СВЧ-излучения, проявляющееся ускорением нормализации активности JAK/STAT-сигнального пути у реконвалесцентов ВП.

4. Низкоинтенсивное излучение частотой 1000 МГц — дополнительный фактор медицинской реабилитации пациентов, перенесших ВП, нормализующий реактивность иммунокомпетентных клеток и активирующий саногенез.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.Х.

Сбор и обработка материалов: С.Б.

Статистическая обработка данных, написание текста: И.Т.