Москвин С.В.

Государственный научный центр лазерной медицины Федерального медико-биологического агентства Минздрава РФ

Ключников Д.Ю.

ГБУЗ "Самарский областной центр планирования семьи и репродукции"

Антипов Е.В.

НОУ ВПО "Медицинский институт РЕАВИЗ", Самара

Волчков С.Е.

ГБУЗ "Самарский областной центр планирования семьи и репродукции"

Киселева О.Н.

НОУ ВПО "Медицинский институт РЕАВИЗ", Самара

Влияние импульсного низкоинтенсивного лазерного излучения красного (635 нм) и инфракрасного (904 нм) спектров на мезенхимальные стволовые клетки человека in vitro

Журнал: Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры. 2014;91(6): 40-47

Просмотров : 72

Загрузок : 3

Как цитировать

Москвин С. В., Ключников Д. Ю., Антипов Е. В., Волчков С. Е., Киселева О. Н. Влияние импульсного низкоинтенсивного лазерного излучения красного (635 нм) и инфракрасного (904 нм) спектров на мезенхимальные стволовые клетки человека in vitro. Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры. 2014;91(6):40-47.

Авторы:

Москвин С.В.

Государственный научный центр лазерной медицины Федерального медико-биологического агентства Минздрава РФ

Все авторы (5)

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) давно привлекают внимание исследователей и практических врачей с точки зрения их возможного использования для заместительной или восстановительной терапии заболеваний, генной или клеточной инженерии [1].

МСК - мультипотентные стромальные клетки, способны к дифференцировке в различные типы клеток тканей - остеобласты, хондроциты, адипоциты, миобласты, гепатоциты, кардиомиоциты и др. [1-3]. МСК человека сохраняют способность к пролиферации и дифференцировке при культивировании in vitro, а также при реимплантации, что обусловливает их высокую значимость в клинической практике [1]. Есть данные о возможности получения из МСК нейрональных предшественников с последующей дифференцировкой их в клетки нервной ткани (нейроны, астроциты, олигодендроциты) [4-7]. Известно, что МСК секретируют почти все основные провоспалительные цитокины и ростовые факторы [2].

Если будут найдены условия для расширения мультипотентности мезенхимальных стволовых клеток до плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток, в регенеративно-пластической медицине автоматически разрешатся многие проблемы этического, морального, религиозного и юридического характера. Одним из известных способов неспецифического регулирования клеточной активности МСК на этапе предварительного культивирования in vitro является воздействие низкоинтенсивным лазерным излучением (НИЛИ). Для чего использовали лазерные источники разной длины волны, работающие в основном в непрерывном режиме (табл. 1).

Использовали практически только непрерывные лазеры в широком диапазоне длин волн и экспозиций, при этом средняя мощность и плотность мощности (ПМ) чаще всего минимальны. Итоговая энергетическая плотность (ЭП) находится в достаточно узких пределах, характерных для эффектов, наблюдаемых в других типах клеток [8], хотя сама по себе ЭП (или так называемая доза) абсолютно неинформативна, а важнейшие параметры методики воздействия часто не указываются [9, 10].

Имеются также данные в отношении других стволовых клеток и физических факторов, в частности F. Eduardo и соавт. [26] показали, что стволовые клетки пульпы зубов человека (hDPSC) положительно реагируют на лазерное освечивание (длина волны 660 нм, мощность 20 мВт, экспозиция 6 с), усиливается клеточный рост и повышается жизнеспособность клеток, но только когда их культивируют в условиях питательного дефицита. Акустические импульсы увеличивают пролиферативную активность ослабленных МСК человека на 80%. Синергизма в усилении пролиферации при комбинировании с низкоинтенсивным КВЧ-излучением (длина волны 7,1 мм) обнаружено не было [27].

Из таблицы видно, насколько разнообразны получаемые эффекты, но все они кальцийзависимые, поскольку первичным механизмом стимуляции клеточной активности (физиологии) является термодинамический запуск Ca2+-зависимых процессов [28]. Также известно, что при увеличении внутриклеточного кальция снижается вероятность гибели по механизму апоптоза и повышается выживаемость эмбриональных стволовых клеток in vitro [29], МСК in vivo [30].

В отношении возможного влияния некогерентного света на МСК данные противоречивые. Установлено почти 2-кратное увеличение пролиферации МСК in vitro после освечивания широкополосным светом (ЭП 2,4-7,2 Дж/см2) [31]. Некогерентный свет (светоизлучающие диоды, СИД) (ЭП 2-4 Дж/см2) не влияет на остеогенную дифференцировку МСК в норме, но усиливает дифференцировку и уменьшает пролиферацию в средах с остеогенными добавками [32]. Наша точка зрения в отношении некогерентных источников однозначна - бесполезны, необходимо использовать только лазерный монохроматический свет для эффективного воздействия, получения максимального отклика биологических систем разного уровня организации [8].

Также показано, что после одного воздействия наблюдается лишь кратковременное повышение пролиферации (630 нм, 15 мВт/см2, ЭП 4 Дж/см2), эффект усиливается после многократного освечивания и при низкой плотности клеток [33]. Это подтверждает известный факт необходимости ежедневного 3-5-кратного повторного освечивания с целью накопления эффекта [8].

Не проведено ни одного исследования с применением импульсных лазеров, наиболее распространенных в современной лазерной терапии (длительность светового импульса 10-7 с, импульсная мощность 5-10 Вт, длина волны 635 и 904 нм), хотя во многих публикациях показана их высокая эффективность как in vitro, так и in vivo [8, 34]. Не изучались перспективные возможности частотной модуляции.

В задачи нашего исследования входила оценка влияния импульсного НИЛИ инфракрасного (904 нм) и красного (635 нм) спектров, в том числе с использованием многочастотного режима, на морфологию, жизнеспособность, пролиферативную активность и скорость роста МСК in vitro.

Материал и методы

Культура клеток. В эксперименте использовалась адгезивная культура МСК, 4 пассажа, полученных из ткани пуповины донора, давшего информированное согласие. Забор, транспортировка и обработка материала проводились в течение 24 ч с момента родов. МСК получены методом эксплантов с последующим культивированием фрагментов.

Культивирование проводили в течение 6 сут, с использованием стандартных питательных сред: Minimum Essential Medium Eagle, Alpha Modification with NaHCO3 («Sigma-Aldrich», Германия), 2 mM L-глютамина («ПанЭко», Россия), 10% сыворотки плодов коровы (MSC FBS, Gibco, Австралия). Культивирование проводилось на чашках Петри площадью 11,78 см2 (EasyGrip, «Beckton Dickinson», США). Также использовались: раствор Дальбекко (DPBS, «Биолот», Россия), раствор трипсина-ЭДТА («ПанЭко», Россия), центрифужные пробирки объемом 50 мл (CentriStar, «Corning Inc.», Мексика) и серологические пипетки объемом 25 и 10 мл (Falcon, «Beckton Dickinson», США).

Жизнеспособность клеток (отношение живых к мертвым) оценивали автоматически на анализаторе клеток Vi-Cell XR («Beckman Coulter», США).

Исследование проводилось в пяти группах, при трех чашках (повторениях) в каждой группе. Опытные группы освечивались НИЛИ (параметры представлены в табл. 2), время экспозиции 5 мин на 1 чашку.

Контрольные чашки не подвергалась воздействию. Применяли аппарат лазерный терапевтический Лазмик-ВЛОК (РУ №РЗН 2014/1410 от 06.02.2014), импульсные матричные лазерные излучающие головки, имеющие 8 лазерных диодов, расположенных в два ряда, что обеспечивает относительно равномерную засветку почти эллиптической области 5×7 см на расстоянии 7 см от поверхности.

Чашки диаметром 3,5 см полностью находились в световом поле (рис. 1), и на них приходилось соответственно ≈10% падающей световой энергии.

Рисунок 1. Расположение лазерной излучающей головки относительно чашки с культурой клетки МСК.
Исходя из этого рассчитывалась ПМ и ЭП для каждого варианта освечивания. В режиме многочастотной модуляции Лазмик используется сложная многочастотная модуляция [8]. Требование к равномерному освечиванию всей поверхности плашки (лунки) связано с тем, что в этом случае обеспечивается лучший эффект, чем при локальном, точечном воздействии на часть культуры клеток [18, 35].

Непосредственно перед освечиванием МСК были инокулированы в количестве 3,7·103 живых клеток/см2 поверхности культуральной посуды в каждую чашку Петри исследуемых и контрольной групп. Дальнейшее культивирование осуществлялось при +37 °С, CO2 5% в течение пяти дней. Визуальное наблюдение за морфологией и ростом культуры проводилось ежедневно методом световой микроскопии до достижения монослоя в одной из групп. После этого был проведен подсчет общего количества клеток в каждой группе. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы SigmaPlot version 11.0.

Результаты и обсуждение

Начиная с первого дня культивирования на всех исследуемых посудах можно было наблюдать клетки, находящиеся на разных стадиях деления (рис. 2).

Рисунок 2. Культура МСК в группах через сутки после освечивания.
При оценке клетки всех групп были идентичными, обладали высокой степенью адгезии к пластику, образовывали веретенообразную или треугольную форму. При изучении морфологии отдельных клеток на 1-е сутки культивирования можно было заметить, что подавляющая часть клеток имела схожие признаки - цитоплазма клеток светлая, хорошо структурированная, края четкие, ядра с одним-двумя ядрышками без каких-либо нетипичных включений.

При дальнейшем культивировании отмечался относительно равномерный рост культуры по всей поверхности пластика. Значимых изменений в морфологии клеток среди изучаемых и контрольной групп выявлено не было. На 5-й день культивирования морфологическая картина не изменилась и являлась типичной для культуры МСК. Межклеточные контакты плотные, клетки достигают монослоя во всех группах. Анализ диаметра клеток показал отсутствие разницы в размерах клеток в разных группах и во все дни культивирования.

Таким образом, морфологический анализ не выявил различий в морфологии клеток между контрольной и экспериментальными группами в процессе культивирования. Жизнеспособность в группах также не различалась.

С 1-го по 5-й день культивирования количество клеток в поле зрения оценивалось визуально с учетом показателя процент монослоя на поверхности культуральной посуды. Подсчет клеток проводили как в ручном, так и в автоматическом режиме. На рис. 3 представлено количество клеток в поле зрения через сутки после освечивания.

Рисунок 3. Количество клеток в поле зрения через сутки после освечивания.
Во всех группах освечивания наблюдалось превышение количества клеток относительно контроля, в наибольшей степени в группе ОЛ (904 нм, режим модуляции Лазмик). Хотя эти выводы, скорее всего, требуют дальнейшего уточнения и подтверждения.

Оценка монослоя (площадь, занимаемая клетками) визуально проводилась в течение пяти суток культивирования (рис. 4).

Рисунок 4. Процент площади поверхности, занимаемый клетками в процессе культивирования.
Общий характер изменений был идентичен для всех клеток, но в группах, подвергшихся освечиванию, более выражен рост в первые 3 дня, что свидетельствует о стимулировании внутриклеточных процессов на первом этапе деления.

Из представленных графиков, к сожалению, невозможно сделать однозначный вывод в пользу того или иного режима, поскольку исследование носило предварительный, оценочный характер, а для оптимизации параметров воздействия необходима большая детализация режимов и их комбинаций.

На наш взгляд, также перспективно рассматривать результаты предварительного освечивания in vitro как часть комплексной программы по конечному результату возможного приживления и нужной дифференцировки. Способность НИЛИ стимулировать пролиферацию клеток [36] и производство ангиогенных факторов, таких как васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF) [37], предполагает возможность создания среды, которая является оптимальной для роста стволовых клеток in vivo [38]. Уже есть несколько работ, в которых проводили освечивание НИЛИ уже после пересадки МСК в различные ткани (табл. 3).

Про оптимизацию параметров лазерного света и самой методики, прежде всего речь идет о времени экспозиции, говорить пока рано, это требует дополнительных исследований. Возможность двойного, двухэтапного освечивания пока вообще не изучалась.

В пользу необходимости последовательного варианта лазерного воздействия могут свидетельствовать положительные результаты технологии имплантации эмбриональных нервных клеток в полностью рассеченный спинной мозг с последующим освечиванием НИЛИ (780 нм, 100 мВт, 30 мин) участка регенерации, когда намного лучшие результаты достигались после предварительного лазерного освечивания культуры клеток (780 нм, 50 мВт, 1 мин) [43, 44]. По аналогии можно было бы предположить, что и с МСК лучше было бы проводить предварительное освечивание на этапе культивирования, а затем после их пересадки.

Но даже без этого местное воздействие лазерным светом позволяет получить положительные результаты. Воздействие импульсным ИК НИЛИ (длина волны 890 нм, импульсная мощность 10 Вт, частота 150 Гц, экспозиция 5 мин, 7 ежедневных воздействий) чрескожно на область сердца экспериментальных крыс Вистар и системное введение аутологичных МСК, полученных культивированием клеток костного мозга, повышает пролиферативную активность клеток стромы, полнокровие мышцы сердца, усиливает ангиогенез, активизирует процессы репаративной регенерации миокарда [45]. Накопленные в настоящее время данные актуализируют научные исследования по выявлению специфических механизмов влияния НИЛИ на скорость миграции, пролиферативную активность и дифференцировку стволовых клеток, повышение физиологической устойчивости и жизнеспособности стволовых клеток при их трансплантации, индукцию выработки факторов роста, что позволит в полной мере использовать регенераторный потенциал лазерного излучения [46].

Заключение

Результаты предварительного изучения возможного влияния импульсного НИЛИ инфракрасного (904 нм) и красного (635 нм) спектров, в том числе с использованием многочастотного режима Лазмик, на морфологию, жизнеспособность, пролиферативную активность и скорость роста мезенхимальных стволовых клеток in vitro показали, что при используемых энергетических и временных параметрах воздействия их морфология и жизнеспособность не меняется.

В то же время наблюдалось небольшое превышение количества клеток относительно контроля, лучший эффект после освечивания инфракрасным (904 нм) импульсным НИЛИ в режиме многочастотной модуляции Лазмик [8]. Эффект проявлялся в наибольшей степени в период с 1-го по 3-й день культивирования.

Необходимо проведение дополнительных исследований для оптимизации параметров воздействия (длина волны, мощность, время и пр.) с возможным расширением методики с освечиванием МСК не только предварительно, в культуре, но также после имплантации in vivo.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция, дизайн и редактирование: С.М., Д.К.

Сбор и обработка материала, статистическая обработка данных: С.М., Д.К., Е.А., С.В., О.К.

Написание текста: С.М.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail