Микробиоценоз небных миндалин у практически здоровых лиц

Микробиом представляет собой экосистему, состоящую из совокупности микроорганизмов, которая динамически меняется и находится в тесной симбиотической взаимосвязи с макроорганизмом. Микробиом выполняет множество различных функций, в том числе формирование колонизационной резистентности, поддержание гомеостаза, участие в иммунных реакциях, водно-солевом обмене, синтезе витаминов, детоксикации ксенобиотиков и т. д. [1]. Учитывая тесную взаимосвязь между микробиоценозом и макроорганизмом, изменения количественного и качественного состава микробиома будут влиять на состояние как отдельных органов и систем, так и в целом на здоровье человека.

Существенный вклад в изучение микрофлоры человека вносит осуществляемый в настоящее время международный проект Human Microbiome Project, инициированный в 2008 г. National Institutes of Health [1]. Задачами этого проекта являются исследование микробиома человека, выявление взаимосвязей между изменением состава сообщества микроорганизмов и здоровьем/патологией человека, а также создание стандартизованного методологического подхода и информационного ресурса для его изучения. В ходе выполнения проекта разработаны унифицированные молекулярно-генетические методы идентификации микроорганизмов, составляющих микробиом. Количество вновь открываемых видов микроорганизмов значительно возросло благодаря применению последних достижений метагеномных исследований и особенно высокопроизводительного секвенирования при изучении микробиоценозов [2—4].

Исследования, посвященные изучению микробных сообществ, показали, что микроорганизмы в них обмениваются между собой сигнальными молекулами, стимулирующими или ингибирующими их рост, а также изменяют величину экспрессии их факторов патогенности и персистенции [2, 3, 5, 6].

Ротоглотка представляет собой уникальный микробиоценоз, находящийся на стыке дыхательной и пищеварительной систем, который играет несомненную роль в профилактике инфекций респираторного тракта [4, 7—10]. Микробиом ротоглотки включает в себя многообразие видов микроорганизмов, большинство из которых являются резидентными, приспособленными к колонизации в этом биотопе и взаимодействующими с местными эпителиальными клетками и лимфаденоидной тканью [11].

Нормальная микрофлора ротоглотки активно участвует в поддержании общего гомеостаза и защите нашего организма от обсеменения болезнетворными микроорганизмами. Кроме того, резидентная микрофлора участвует в синтезе витаминов, источников энергии и метаболитов, которые обладают противовоспалительными и антиоксидантными свойствами. Но при сбоях в иммунной системе, воздействии респираторных вирусных патогенов, а также при наличии источника инфекции в полости рта нарушается баланс между резидентными и транзиторными микроорганизмами, что приводит к появлению различной патологической симптоматики. Помимо этого, микрофлора ротоглотки у здоровых людей также зависит от степени очищения слизистой оболочки от остатков пищи, клеточного детрита, слизи, которые служат питательной средой для многих микроорганизмов [7, 9].

Необходимо отметить, что в норме микробиоценозы представляют собой сложные динамические структуры, в состав которых входят резидентные и транзиторные микроорганизмы [1]. Соотношения микроорганизмов в разных биотопах различаются и при разных состояниях здоровья. Изучение микробиоценозов и их роли в поддержании здоровья и развитии патологии является сложной многофакторной задачей, включающей исследование не только самих микробных сообществ, но и компонентов и метаболитов микрофлоры, взаимодействий с макроорганизмом с учетом персонификации и социальных факторов (проживание в разных регионах, загрязнение воздуха, курение, уход за полостью рта и т. д.) [7, 8]. Кроме того, было установлено, что потеря разнообразия в микробиоме ведет к снижению защитного влияния микробиома, развитию широкого диапазона неблагоприятных влияний и патологии [10]. Исследованиями было показано влияние микробиома на развитие таких заболеваний, как атеросклероз, болезнь Паркинсона, ожирение, сахарный диабет 2-го типа и аутизм. Кроме того, микробиом является резервуаром генов резистентности к антибактериальным препаратам [1].

Таким образом, можно утверждать, что возникновение, степень тяжести, а также интенсивность развития гнойно-воспалительных заболеваний ротоглотки напрямую зависят от качественного и количественного состава микрофлоры, контаминирующей слизистую оболочку ротоглотки, в частности небных миндалин, а также от индивидуальных биологических свойств данных микроорганизмов.

Учитывая тот факт, что микрофлора проксимальных отделов лакун небных миндалин в отличие от остальных отделов слизистой оболочки ротоглотки минимально подвержена воздействию различных экзогенных факторов, она представляет собой относительно стабильный по качественному и количественному составу биоценоз. В то же время хорошая оксигенация данного отдела лакун небных миндалин в отличие от дистальных отделов предполагает те же физиологические условия персистенции микроорганизмов, что и на слизистой оболочке задней и боковых стенок глотки, небных дужках и т. д.

Цель исследования — изучение количественного и качественного состава культивируемых микроорганизмов, выделенных из проксимальных отделов лакун небных миндалин у практически здоровых лиц.

В исследовании принимало участие 48 практически здоровых лиц — добровольцев в возрасте от 18 до 30 лет в период с октября 2016 г. по апрель 2017 г., из них 28 (58,3%) женщин и 20 (41,7%) мужчин. К практически здоровым относили обследуемых, в анамнезе которых не было хронических заболеваний ЛОР-органов, отсутствовали жалобы и объективные признаки патологических изменений ротоглотки на момент обследования.

Взятие материала из проксимальных отделов лакун небных миндалин осуществляли утром натощак с помощью стерильных одноразовых сухих коммерческих тампонов («Copan», Италия), его доставляли в лабораторию в термоконтейнерах в течение 2 ч, соблюдая температурный режим.

Для стандартизации количественной оценки роста микроорганизмов клинический материал засевали по Голду тампоном на 0,5 чашки с 20% агаром с кровью крупного рогатого скота («Лейтран», Москва), в качестве агаровой основы использовали сухой питательный ГРМ-агар (ГНЦПМБ, Оболенск). Посев осуществляли плотными непрерывными штрихами (сектор А) и рассевом калибровочной петлей 10 мкл на секторы I, II и III. Параллельно клинический материал с тампонов засевали на следующие питательные среды: уриселект («Bio-Rad», США), желточно-солевой агар (на основе солевого агара) и агар Сабуро («HiMedia», Индия). Все посевы культивировали по стандартной методике при температуре 37 °C в течение 24—48 ч.

Идентификацию микроорганизмов проводили по культурально-морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам. Тинкториальные свойства изучали методом окраски по Граму по общепринятой методике в соответствии с инструкцией производителя. Биохимическую идентификацию выделенных микроорганизмов осуществляли с помощью коммерческих биохимических тест-систем PLIVA-Lachema Diagnostica (Чехия).

Для видовой идентификации микроорганизмов использовали масс-cпектрометрический метод с помощью времяпролетного масс-спектрометра BioMerieux VITEK MS MALDI-TOF («bioMerieux», Франция) и секвенирование гена 16SrRNA.

Хромосомальную ДНК выделяли методом кипячения из чистых культур бактерий, выращенных на кровяном агаре по методу Т. Маниатис (1984). Далее одну микробиологическую петлю культуры суспендировали в 150 мкл деионизированной воды и инкубировали 20 мин при 95 °C, после чего центрифугировали при 12 000 об/мин. Выявление фрагментов гена 16SrRNA осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции по стандартному протоколу [2, 3]. Реакционная смесь содержала 1,5 ммоль MgCl₂, 10 ммоль Tris-HCl (pH 8,3), 50 ммоль KCl, 1,0 мкмоль каждого праймера, по 200 мкмоль каждого дезоксинуклеозидтрифосфата («Fermentas», Литва) и 1UTaq-DNA полимеразы («Fermentas», Литва) в окончательном объеме 25 мкл. Амплификацию фрагментов нуклеотидных последовательностей проводили в термоциклере Терцик («ДНК-технология», Москва) и С-1000 Touch («Bio-Rad», США). Детекцию результатов амплификации осуществляли путем постановки горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле при 160 V в течение 40 мин с последующим сравнением электрофоретической подвижности специфических светящихся фрагментов амплифицированных продуктов с подвижностью фрагментов маркера молекулярных весов DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). Секвенирование фрагментов ДНК штаммов коринебактерий осуществляли согласно общепринятому методу Сэнгера (Sanger F.) в компании ЗАО «Евроген» (Москва). Результаты секвенирования обрабатывали с помощью программного обеспечения BLAST и ChromasLite (для формата хроматограммы), секвенированные последовательности сопоставляли с международной онлайн-базой данных EMBL/NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore).

С целью установления количественного состава микрофлоры, колонизирующей биотоп проксимальных отделов лакун небных миндалин, обследованы 48 практически здоровых людей в возрасте от 18 до 30 лет. Полуколичественную оценку микробного роста провели на основе эмпирических исследований в зависимости от количества выросших колоний при прямом посеве биоматериала, в пересчете в КОЕ/мл/г (см. таблицу).

Количественная оценка микробного роста показала, что у практически здоровых лиц степень обсемененности лакун небных миндалин микроорганизмами варьировала от 3 до 6 Lg КОЕ/мл. Количество выросших колоний при прямом посеве составило в концентрации 3 Lg КОЕ/мл — 8,3%, 4 Lg КОЕ/мл — 25%, 5 Lg КОЕ/мл — 25%, 6Lg КОЕ/мл — 41,7%. Следовательно, у большинства обследованных лиц в микробиоте миндалин выявлена средняя степень микробной обсемененности в пределах 4—6 Lg КОЕ/мл.

В результате проведенного анализа микробного пейзажа культивируемых микроорганизмов, выделенных из проксимальных отделов лакун небных миндалин практически здоровых лиц, идентифицировано 153 различных штамма, принадлежащих к 6 родам микроорганизмов. Из них большинство штаммов — 54 (35,4%) — принадлежало к роду Streptococcus; 36 (23,5%) штаммов — к роду Rothia; 21 (13,7%) штаммов — к роду Actinomyces; 18 (11,7%%) — к роду Staphylococcus, 15 (9,8%) штаммов — к роду Corynebacterium и 9 (5,9%) штаммов — к роду Micrococcus.

В исследуемом микробиоме наиболее многочисленной и разнообразной по видовому составу была группа микроорганизмов рода Streptococcus. При этом было идентифицировано 54 штамма, относящихся к 5 видам микроорганизмов этого рода. Наибольший удельный вес в структуре микробного пейзажа имели α- и γ-гемолитические стрептококки: Streptococcus parasanguinis — 27 (50%) штаммов, Streptococcus mitis — 12 (22,1%) штаммов, Streptococcus salivarius — 9 (16,7%) штаммов, Streptococcus oligofermentans — 3 (5,6%) штамма, а также не определенные до видовой принадлежности Streptococcus spр. — 3 (5,6%).

Второй по распространенности группой микроорганизмов явились бактерии рода Rothia являющиеся родом грамположительных, неподвижных, не образующих спор бактерий. В ходе исследования нами было идентифицировано 36 штаммов, относящихся к 2 видам микроорганизмов этого рода. Из них 30 (83,3%) штаммов относились к виду Rothia mucilaginosa и 6 (16,7%) штаммов — к виду Rothia dentocariosa.

Среди микроорганизмов, относящихся к родам Actinomyces и Staphylococcus, выделены штаммы только одного вида — 21 штамм Actinomyces spр. оral и 18 штаммов Staphylococcus аureus. Также в биотопе миндалин идентифицировано 15 штаммов, относящихся к роду Corynebacterium. Среди них по 6 (40%) штаммов принадлежало к видам Corynebacterium accolens и Corynebacterium tuberculostearicum, 3 (20%) штамма принадлежало к Corynebacterium spр. Помимо этого, 9 штаммов были идентифицированы как Micrococcus luteus.

Количественный состав микроорганизмов, выделенных с миндалин мужчин и женщин, был практически одинаковым — 78 (51%) и 75 (49%) штаммов соответственно. Однако на этом фоне удалось обнаружить определенные различия в качественном составе микроорганизмов. Так, у мужчин обнаружено 10 видов микроорганизмов, в то время как у женщин — 8 видов. Видовой состав выделенных бактерий представлен на рисунке.

При этом у всех обследованных лиц обнаружены ассоциации микроорганизмов, из которых идентифицированы ассоциации из 4 (50%), 5 (41,6%) и 3 (38,4%) микроорганизмов. Наиболее распространенными в качественном составе ассоциаций явились штаммы R. mucilaginosa и Actinomyces spр. оral (83,3 и 58,3% случаев соответственно). Следующим по распространенности в ассоциациях были штаммы S. parasanguinis и S. salivarius — по 33,3% случаев.

Проведенные с помощью технологий секвенирования геномов бактерий в последние годы исследования показали, что в ротоглотке имеются пять филотипов микроорганизмов — Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinobacteria и Fusobacteria [5, 9, 10]. Однако в большинстве представленных работ проведенный метагеномный анализ дает представление только о родах микроорганизмов без идентификации видового состава, в то время как проведенное нами исследование с помощью масс-спектрометрии и секвенирования геномов показало, что микробиом проксимальных отделов лакун небных миндалин (который в качественном составе соответствует рецидентной микрофлоре ротоглотки) у практически здоровых лиц в возрасте от 18 до 30 лет представляет собой гетерогенную бактериальную популяцию (консорциум) с определенной плотностью, состоящую из 4—5 бактериальных ассоциаций с преимущественным преобладанием грамположительных микроорганизмов. Все выделенные нами микроорганизмы относились к двум филотипам — Proteobacteria и Actinobacteria. Среди этих филотипов у обследуемых практически здоровых лиц молодого возраста доминировали микроорганизмы рода Streptococcus, на втором месте по частоте встречаемости — микроорганизмы рода Rothia, на третьем месте — микроорганизмы родов Actinomyces и Staphylococcus и в единичных количествах — представители родов Corynebacterium и Micrococcus.

Проведенные нами исследования позволили охарактеризовать микробиоценоз миндалин у практически здоровых лиц в возрасте от 18 до 30 лет. С помощью масс-спектрометрического метода секвенирования идентифицировано 153 штамма, относящихся к 6 родам 2 филотипов, которые встречаются в виде ассоциаций из 4—5 микроорганизмов с доминированием микроорганизмов рода Streptococcus. Полученные данные расширяют знания о микробиоме ротоглотки и создают предпосылки для уточнения вклада микробиотических сообществ в развитие заболеваний верхних дыхательных путей. Изучение состава микробных ассоциаций необходимо для понимания взаимосвязи между изменчивостью микробиома — здоровьем — болезнью, а также для определения понятий «основной человеческий микробиом» и «молекулярные маркеры диагностики дисбиозов».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

^{1, 2}e-mail: olgborisova@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-6316-5046