До недавнего времени механизмы нейрональной регуляции функций верхних дыхательных путей объяснялись исключительно деятельностью вегетативной нервной системы, но работы последних лет свидетельствуют о значительной роли афферентной нервной системы в организации основных функций слизистой оболочки - барьерной, защитной, секреторной и т.д. [1-3]. Пептидергические афферентные нервы, кроме того, имеют большое значение в развитии патологических процессов [1, 3-5]. С тех пор как было установлено, что стимуляция афферентных нервов и высвобождение пептидных медиаторов могут приводить к развитию воспаления, роль нервной системы в этом процессе активно исследуется. Нейрогенное воспаление - это комплекс патологических событий в периферических тканях, инициируемый и поддерживаемый за счет влияния афферентных нервов и их пептидных нейромедиаторов [1, 4]. Данные мировой литературы убедительно свидетельствуют о том, что с «нейрогенным» воспалением связано большинство дегенеративных и пролиферативных процессов [6]. В патогенезе таких заболеваний, как астма, ринит, контактный дерматит, мигрень и ревматоидный артрит, участие нейрогенного воспаления является общепризнанным и доказанным [7-9]. С деятельностью нейропептидов (вещество Р - SP, нейрокинин А, CGRP) связывают развитие патологических симптомов при заболеваниях слизистой оболочки дыхательных путей - кашель, чиханье, зуд, гиперсекрецию слизи, а также болевой синдром [1-5].

В процессе структурного ремоделирования тканей слизистой оболочки дыхательных путей, кроме того, могут участвовать протеолитические ферменты межклеточного матрикса. Тканевые матриксные металлопротеиназы (ММР) участвуют в структурной адаптации тканей к действию факторов внешней агрессивной среды и в развитии необратимых патологических состояний [10-12]. Их значение максимально полно исследовано при инвазии раковых опухолей; роль в развитии других процессов в настоящее время активно изучается [13, 14].

Многочисленные данные, полученные на лабораторных животных, свидетельствуют о том, что нейропептиды и ММР значительно изменяют свою активность при моделировании патологии дыхательных путей, вызванной хроническим табакокурением (ХТК) [5, 6, 15-18]. Детальное исследование этих процессов может создать предпосылки для разработки новых лекарственных средств, лечения никотин-ассоциированных заболеваний. Однако вопрос о том, насколько сходными являются перестройки данных систем в слизистой оболочке животных и людей, является неизученными.

Цель работы - изучение активности ряда параметров структурного ремоделирования тканей слизистой оболочки носа людей с анамнезом хронического табакокурения (ХТК). Для обоснования роли нейрогенных механизмов воспаления в ремоделировании тканей слизистой оболочки полости носа при хроническом табакокурении изучена клеточная и тканевая локализация вещества Р (SP) и нейрокининовых рецепторов (SPR). Для выявления механизмов, с помощью которых происходит перестройка тканей, исследована активность ферментов межклеточного матрикса - ММР9 и TIMP-2. Контролем служил материал слизистой оболочки носа никогда не куривших людей.

Был исследован аутопсийный материал слизистой оболочки носа, полученный в ходе судебно-медицинского исследования лиц разного пола в возрасте от 18 до 55 лет, умерших от внезапной смерти вне стационара и не имевших серьезной соматической патологии и сопутствующих заболеваний носа и околоносовых пазух (ОНП). История табакокурения была выявлена в ходе опроса родственников. Морфологическое и иммуногистохимическое (ИГХ) исследование выполнено на материале, полученном от 28 человек с анамнезом ХТК (средний возраст 36,5 лет, из них 25% женщин и 75% мужчин) и 22 человек без анамнеза ХТК (средний возраст 33,5 лет, из них 38% женщин и 62% мужчин).

Локализацию и уровень SP, SPR (нейрокининовые рецепторы), ММР9 и TIMP-2 в тканях слизистой оболочки полости носа осуществляли с помощью иммуногистохимических (ИГХ) методов на парафиновых срезах толщиной 15 мкм согласно стандартной методике. В работе использованы следующие первичные антитела: anti-MMP9 (rabbitpolyclonal, ThermoScientific, rb-9234-p, 1:200), anti-TIMP-2 (rabbitpolyclonal, Abcam, ab 61224, 1:100), anti-SP (Abcam, ab 14184, 1:200, США), анти-SPR (ChemiconAB 5060, 1:500, США), а также биотинилированные вторичные антитела (ThermoScientific, 1:200), стрептавидин-пероксидаза (ThermoScientific) и хромоген (PeroxidaseSubstrateKit, VectorNovaRED, SK-4800). Инкубация с первичными антителами осуществлялась при температуре +4°С в течение 12 ч, обработка вторичными антителами и хромогеном проводилась в соответствии с рекомендациями фирм-производителей. Для анализа морфологических изменений тканей и проведения подсчета числа иммунопозитивных элементов некоторые параллельные препараты после окраски хромогеном докрашивались гематоксилином и эозином по стандартной методике. Для анализа структуры эпителия мы обращали внимание на следующие морфологические признаки - высоту эпителиального пласта, наличие признаков метаплазии и десквамации эпителия, число бокаловидных клеток, размеры слизистых желез.

Об уровне активности исследуемых маркеров в образцах ткани судили по количеству иммунопозитивных клеток в отдельных структурах, их процентному содержанию, или по площади (в %), занимаемой образующимся продуктом ИГХ-реакции в отдельных слоях слизистой оболочки. Оценка количества окрашенных клеток производилась на каждом срезе в 10 неперекрывающихся полях зрения с использованием микроскопа AxioScopeA1 («Carl Zeiss»). Определение площади ИГХ-окрашивания проводили с использованием программы ImageJ4.0 после получения изображения камерой AxioCamICc3 Rev.3 («Carl Zeiss»). Морфометрия проводилась на срезах, не докрашенных гематоксилином и эозином.

Статистическую обработку данных проводили в программе Microsoft Excel 97 с определением средней арифметической, среднего квадратичного отклонения, t-критерия. Различия считали достоверными при р≤0,05.

Морфологические изменения слизистой оболочки носа при ХТК.

В контрольной группе мерцательный эпителий имел равномерную толщину по всей длине, без признаков десквамации и метаплазии. Высота эпителия составляла 22,3±2,7 мкм с сохранением многорядности и наличием основных клеточных компонентов (табл. 1).

У курильщиков морфологические изменения наблюдались во всех слоях слизистой оболочки. Изменения эпителия характеризовались наличием обширных участков со слущенным, метаплазированным или частично ороговевшим эпителием. На участках сохраненного респираторного эпителия его высота была увеличена по сравнению с группой контроля до 33,81±4,31 мкм, значительно возросло число бокаловидных клеток. В собственной пластинке слизистой оболочки и в подслизистом слое наблюдались очаговые лимфоидные инфильтраты. В исследованных образцах достоверного изменения диаметра желез подслизистой основы не обнаружено (см. табл. 1).

Активность компонентов нейрокининовой системы при ХТК

Максимальная плотность скопления SP-позитивных нервных волокон обнаруживалась в собственной пластинке слизистой оболочки, где они оплетают кровеносные сосуды и выводные протоки желез. Достоверных изменений в числе и характере распределения афферентных волокон у людей с анамнезом ХТК не выявлено. Однако ИГХ-диагностика распределения нейрокининовых рецепторов (SPR) демонстрировала значительные изменения.

Рецепторы к веществу Р были обнаружены в тканевых элементах всех слоев слизистой оболочки носа. В составе респираторного эпителия рецепторы локализованы на реснитчатых и бокаловидных клетках. В реснитчатых клетках ИГХ активность распределена исключительно в апикальном полюсе. Бокаловидные клетки окрашиваются целиком, за исключением области ядра (см. рисунок, а на цв. вклейке).

В подслизистой основе нейрокининовые рецепторы распределяются на поверхности гландулоцитов и клетках межжелезистой соединительной ткани. Здесь площадь SPR-позитивной зоны составляет в норме 35,77±4,17%.

У курильщиков активность нейрокининовых структур резко возрастает, занимая до 78,53±6,84% площади ткани (см. рисунок, б на цв. вклейке).

Нарушение характера афферентной SP-ергической иннервации подслизистой оболочки и изменение активности рецепторов в дыхательном эпителии, как известно, могут приводить у курильщиков к нарушению барьерной, секреторной, защитной функции и создавать предпосылки для развития необратимых структурных перестроек [19]. Это реализуется разными путями. Например, SР усиливает активацию маркеров адгезии эндотелиальных клеток, что позволяет циркулирующим лейкоцитам фиксироваться к стенке сосуда. В присутствии дополнительных хемоаттрактантов эти лейкоциты начинают проникать в ткани и участвовать в дальнейшем развитии воспалительного ответа [20]. На наших препаратах данное явление представлено многочисленными лимфоидными инфильтратами в местах распределения SPR-иммуноактивности. Местное высвобождение тахикининов (особенно на фоне повышенного числа селективных рецепторов) выражается ощущением боли, отека слизистой, усилением секреции [21], повышением сосудистой проницаемости [22], и может играть роль защитной реакции на раздражитель [21, 23]. В свою очередь, развивающийся каскад нейроиммунных взаимодействий способствует усилению симптомов ринита [21], риносинусита [5].

Известно, что при курении и действии агрессивных факторов внешней среды происходят увеличение количества бокаловидных клеток и гипертрофия слизистых желез. Будучи по своей природе защитным, этот механизм может являться одним из важных показателей ремоделирования слизистой оболочки [24]. Тот факт, что максимальные изменения SPR-активности в эпителии обнаруживаются в бокаловидных клетках, может свидетельствовать о роли нейрокининовой системы в функционировании именно этого типа клеток [25].

Иммуногистохимическая активность ферментов межклеточного матрикса в слизистой оболочке носа людей при ХТК

В контрольной группе ИГХ активность ММР9 локализована в эпителии слизистой оболочки носа (СОН) (см. рисунок, в на цв. вклейке). В значительно меньшей степени фермент локализован в подслизистой основе (см. рисунок, д на цв. вклейке). Кровеносные сосуды окружены тонкой прослойкой ММР9-содержащей ткани, эндотелий сосудов фермента не содержит. В норме площадь, занимаемая ферментом в соединительнотканных слоях, составляет 26,01±1,71 (табл. 2).

В группе курильщиков заметно возрастала активность ММР9. Наиболее выраженные изменения наблюдали в эпителии - там площадь ММР9-позитивной зоны возрастает до 56,76±2,31 (см. рисунок, г на цв. вклейке; см. табл. 2). Экспрессия фермента возникала в эндотелиоцитах кровеносных сосудов подслизистой оболочки (преимущественно в артериях среднего диаметра) (см. рисунок, е на цв. вклейке).

Активность TIMP-2 у людей контрольной группы сосредоточена в основном в подслизистой основе. У курильщиков активность тканевого ингибитора TIMP-2 заметно уменьшается (см. табл. 2).

Длительное табакокурение, как показано в нашем исследовании, приводит к значительному изменению активности ферментов, участвующих в регуляции структурных и функциональных свойств межклеточного вещества. ММР9 опосредует огромное многообразие функциональных и патологических процессов - от адаптивного ремоделирования в периоды роста и функциональных нагрузок до инвазии опухолей и развития необратимых дегенеративных перестроек различных органов и тканей [17]. Тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ являются главными эндогенными ингибиторами в тканях и выполняют центральную функцию в поддержании баланса их протеолитической активности [12, 25]. По мнению R. Pawankar и соавт. [24], специфическое взаимодействие между ММР и TIMP является ключевым моментом регуляции ремоделирования тканей поэтому оценивать значение ММР-индуцированных перестроек возможно только при учете сопутствующих изменений в системе их эндогенных ингибиторов [12, 24, 25]. Предпосылкой для развития необратимых структурно-функциональных перестроек является ситуация, при которой активация ММР9 происходит на фоне сниженной активности его ингибитора [24]. Именно такое соотношение выявлено в данной работе. Данный биохимический дисбаланс может лежать в основе структурного ремоделирования стенки дыхательных путей, приводя к глубоким функциональными расстройствам [26].

Таким образом, в ходе проведенного исследования выявлены два важных механизма, потенциально участвующие в структурном и функциональном ремоделировании СОН у людей с анамнезом ХТК.

Во-первых, установлено значительное увеличение активности нейрокининовых рецепторов на клетках мерцательного эпителия и в соединительнотканных элементах подслизистой основы. Такие изменения активности афферентного звена нервной системы могут служить предпосылкой функциональных изменений в сенсорном и секреторном аппарате СОН при интоксикации табаком.

Во-вторых, специфическая динамика активности ММР9 и TIMP-2 у курильщиков свидетельствует о том, что данный тип матриксных металлопротеиназ является исполнителем структурной перестройки СОН.

В целом, полученные результаты согласуются с данными литературы по моделированию хронической никотиновой интоксикации у животных [5, 6, 12, 15, 17, 27]. Это позволяет с большей уверенностью экстраполировать результаты эксперимента на клинические ситуации. Дальнейшее и более детальное исследование механизмов нейрогенного воспаления, функции функций матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов при заболеваниях органов дыхания позволит с новых позиций рассматривать патологические процессы, проходящие в слизистой оболочке лиц с ХТК, оценивать результативность и безопасность проводимого медикаментозного лечения, разрабатывать эффективные профилактические и лечебные мероприятия.