Применение технологии «орган-на-чипе» в экспериментальной офтальмологии

Культуры клеток и тканей in vitro являются универсальными биологическими моделями в сфере биомедицинских исследований. Их применение позволяет значительно удешевить доклинические исследования новых препаратов и сократить их сроки, решить связанные с использованием лабораторных животных этические проблемы и изучить механизмы биологической активности исследуемых соединений на клеточном уровне, в том числе с учетом эффектов взаимодействия нескольких различных веществ [1]. Клеточные и тканевые культуры также находят активное применение в сфере исследований в офтальмологии, например при разработке методов клеточной терапии патологии органа зрения [2].

Дальнейшее развитие культуральных техник и их объединение с микрофлюидными технологиями привело к появлению такой передовой методики, как «орган-на-чипе» (Organ-on-chip), позволяющей моделировать структуру человеческих органов и тканей. Ее существенное отличие от стандартных двух- и трехмерных культур клеток и преимущество перед ними заключается в возможности воспроизводить in vitro минимальную функциональную единицу органа или системы органов. Данный аспект позволяет технологии «орган-на-чипе», оставаясь в группе методов in vitro и сохраняя их преимущества, преодолеть имеющиеся ограничения и приблизиться по точности моделирования к in vivo моделям [3]. В настоящее время технология «орган-на-чипе» позволяет моделировать физиологические процессы в таких органах и структурах организма, как печень, сердце, легкое, гематоэнцефалический барьер [4]. Также технология «орган-на-чипе» позволяет моделировать работу различных структур глаза и его вспомогательного аппарата [5], что делает ее востребованным инструментом экспериментальной и фундаментальной офтальмологии.

Цель обзора — освещение основных направлений использования методики «орган-на-чипе» в современной экспериментальной офтальмологии.

В основе системы «орган-на-чипе» лежит микрофлюидное устройство, которое конструктивно представляет собой пластину из прозрачного материала, в которой имеются микроканалы, обеспечивающие преимущественно ламинарный ток жидкостей; реакционные камеры, содержащие в себе живые клетки одного или нескольких типов; мембраны, на которых также могут располагаться клетки в один или несколько слоев; микроклапаны и насосы [4, 6, 7]. Схема и взаиморасположение каналов и реакционных камер, состав и характер сопряжения клеток разных типов, пути движения контактирующих с клетками сред по каналам микрофлюидного устройства различны в зависимости от моделируемого физиологического или патологического процесса и выбранного протокола исследования.

Микрофлюидное устройство изготавливается из различных материалов, наиболее распространенным из которых является полидиметилсилоксан (PDMS). Данный материал отличается высокой эластичностью, что позволяет выполнять различные манипуляции над клетками прямо в микрофлюидной системе и моделировать механические свойства биологической ткани; оптическая прозрачность обеспечивает возможность визуализации клеток и наблюдения за ними. Хорошая проницаемость для кислорода, биосовместимость и низкая токсичность делают возможным долговременное культивирование клеток в микрофлюидных камерах. Кроме того, процесс изготовления микрофлюидных систем на основе PDMS методом мягкой литографии достаточно дешев и прост [4, 8]. Однако PDMS не лишен и недостатков: он способен адсорбировать малые гидрофобные молекулы, включая компоненты питательной среды, сигнальные молекулы, продуцируемые клетками, и вещества, добавляемые в систему для изучения их эффектов, снижая их концентрацию и внося таким образом искажения в результаты исследования [8—10]. В связи с этим активно исследуются иные материалы для изготовления микрофлюидных систем, среди которых термопластические полимеры (полиметилметакрилат, поликарбонат, полилактид и др.), различные эластомеры (например на основе полиэстера), стекло, керамика, бумага, гидрогели и иные материалы, а также их комбинации [8]. Отдельно из вышеперечисленного стоит выделить такой класс материалов, как активно применяющиеся в исследованиях в сфере тканевой инженерии и регенеративной медицины гидрогели, которые обладают высокой биосовместимостью, имитируют механические и структурные свойства тканей, обеспечивают диффузию кислорода и питательных веществ и обладают обширными возможностями химической модификации [11]. Описанные свойства делают гидрогели сходными с внеклеточным матриксом, что позволяет использовать их не только как материал для самой микрофлюидной системы, но и как среду, непосредственно в объеме которой могут быть иммобилизованы клетки, либо в качестве аналога биологических барьерных структур и мембран, разделяющих разные типы клеток и тканей [8].

Важной стороной систем «орган-на-чипе» является возможность регистрации, мониторинга и анализа происходящих в них процессов, в том числе в режиме реального времени. Поскольку большинство применяемых в системах «орган-на-чипе» микрофлюидных систем изготавливаются из оптически прозрачных материалов, для наблюдения за поведением клеток и током жидкостей в системе применяется оптическая микроскопия [8, 9]. Для других наблюдений непосредственно в систему встраиваются различные сенсоры [4]. Среди них — сенсоры pH, CO₂-сенсоры, O₂-сенсоры, датчики температуры, специальные электрохимические сенсоры, рассчитанные на определенные соединения, биомаркеры и метаболиты, позволяющие оценивать происходящие в системе «орган-на-чипе» метаболические процессы и поддерживать заданные условия культивирования клеток. В системах «орган-на-чипе», предназначенных для оценки тканеинженерных конструкций, могут применяться механосенсоры для оценки механических свойств и реакции на различные механические воздействия. Для регистрации электрической активности возбудимых тканей в систему встраиваются микроэлектроды [12].

Основными структурами переднего отрезка глаза являются роговица, радужка и хрусталик [13]. Роговица, обеспечивающая существенную долю преломляющей силы глаза, кроме того, является важной барьерной структурой, защищающей орган зрения от воздействия внешних факторов, в связи с чем барьерная функция роговичного эпителия является важным аспектом токсикологических исследований [14]. Также культивирование клеток эпителия роговицы на мембранах, встроенных в микрофлюидные системы, позволяет изучать барьерную функцию роговицы и в отношении применяемых топикально препаратов [15]. Первыми системами «орган-на-чипе», моделирующими роговицу, воспроизводилась только вышеназванная структура в виде слоистых конструкций из клеток эпителия и стромы роговицы на мембране из коллагеновго витригеля [5]. Системы такого рода могут быть использованы для выявления раздражающего действия различных соединений на ткани роговицы. Так, внесение щелочи (NaOH) приводит к нарушению целостности тканевых эквивалентов в подобных системах, что является наглядной демонстрацией концепции [16].

Однако для более полного моделирования процессов, происходящих в структурах глазной поверхности, одной лишь роговицы недостаточно — современные системы «орган-на-чипе» обычно моделируют всю глазную поверхность в целом, включая конъюнктиву и слезную пленку [16]. Наиболее совершенные модели «роговицы-на-чипе» обычно носят название blinking eye on a chip, т. е. «моргающий глаз-на-чипе». Из названия следует, что ключевым моментом является моделирование слезной пленки в ее динамике и возникающих в процессе моргания сдвиговых механических нагрузок на роговичный эпителий, играющих большую роль в поддержании гомеостаза самой роговицы и передней камеры, реализации ее барьерной функции и оказывающих влияние на течение патологий роговицы и ее взаимодействие с токсичными и лекарственными веществами [14].

Проиллюстрировать успешную реализацию системы «моргающий глаз на чипе» можно работой J. Seo и соавт. (2019). На куполообразном каркасе, имитирующем форму роговицы, были высеяны соответствующие клетки: в толще каркаса располагали кератоциты для моделирования субэпителиальной стромы, а на его поверхность методом 3D-биопечати нанесли клетки роговичного эпителия в центре и конъюнктивального эпителия по периферии, воспроизводя таким образом взаиморасположение соответствующих структур в человеческом глазу. Полученная тканеинженерная конструкция располагалась в специальной микрофлюидной системе, прокачивающей культуральную среду под куполом, воспроизводя переднюю камеру, где сверху клетки эпителия находились на границе раздела фаз жидкой и газообразной сред, что обеспечивало имитацию слезной пленки. По поверхности тканевого эквивалента роговицы перемещалось приводимое в движение электромеханическим актуатором искусственное веко из гидрогеля с частотой 0,2 Гц, имитируя физиологический акт спонтанного моргания. Разработанная система достаточно точно воспроизводила анатомию и физиологию глазной поверхности: эпителиальные клетки роговицы сформировали структуру из 7—8 слоев клеток, покрывающих строму с кератоцитами. Имелся слой клеток роговичного эпителия, экспрессирующих специфический маркер базальных клеток p63, также роговичными эпителиоцитами экспрессировались цитокератин-3 и -12. Клетки конъюнктивального эпителия экспрессировали цитокератин-19 и муцин. Система позволяла моделировать такую патологию, как синдром сухого глаза: при снижении частоты морганий гидрогелевого века повышалась осмолярность слезной жидкости, уменьшалось время разрыва слезной пленки и снижалась продукция либрицина роговичными эпителиоцитами; флюоресцеиновая проба показывала патологические изменения поверхности. Топикальное внесение либрицина на поверхность роговичного эквивалента приводило к стабилизации слезной пленки и увеличению времени ее разрыва, восстановлению структуры роговичного эпителия, подтверждаемому флюоресцеиновой пробой [17]. Вышеописанная работа демонстрирует возможность детального и высокоточного моделирования нормальной структуры глазной поверхности, а также моделирования ее патологии и применения к ней терапевтической стратегии, что актуально как при изучении патогенеза заболеваний, так и при доклинических испытаниях лекарственных препаратов.

В сравнении с роговицей и глазной поверхностью реализация остальных структур передней камеры глаза в системах «орган-на-чипе» в настоящее время еще не получила аналогичного уровня развития [16]. Наиболее приближенной по концепции к «органу-на-чипе», но не являющейся им в полной мере, можно считать технологию культивирования хрусталиковых телец (микрохрусталиков) — органоидов, воспроизводящих человеческий хрусталик в миниатюре. С их помощью исследуют патогенез катаракты и различные терапевтические стратегии ее профилактики и замедления прогрессирования, а также факторы риска развития этого заболевания [18]. Не исключено, что по мере совершенствования микрофлюидных технологий и накопления новых сведений о физиологии хрусталика и патофизиологии катаракты могут быть созданы системы, в которых хрусталиковые тельца могут быть культивированы в виде «органа-на-чипе». Способность данных органоидов к фокусированию света [19] позволяет сделать предположение о возможности оснащения содержащей их системы «орган-на-чипе» источниками света и оптическими датчиками для оценки их светопропускающей и преломляющей способности и иных оптических свойств под действием различных патологических факторов и лекарственных препаратов.

Кроме моделирования структур переднего отрезка глаза, немаловажным аспектом является и моделирование взаимодействия глазной поверхности с различными медицинскими изделиями. Одним из таких примеров является разработка системы «контактная линза-на-чипе», моделирующая взаимодействие слезной жидкости человека с контактной линзой для персонализированного подбора материала контактных линз и средства по уходу за ними индивидуально конкретному пациенту в зависимости от особенностей состава его слезной жидкости.

Технология может быть проиллюстрирована на примере разработки A. Guan и соавторов, в рамках которой была разработана система «контактная линза-на-чипе», представляющая собой микрофлюидное устройство в виде пластины из PDMS, содержащей ячейки для образцов материала исследуемых контактных линз. Через систему микроканалов к ним могут подаваться образец слезной жидкости пациента и образцы различных средств для ухода за контактными линзами. Система позволяет оценить степень загрязнения контактных линз из разных материалов белковыми и иными компонентами слезной жидкости конкретного пациента, степень очистки линз от данных загрязнений различными средствами по уходу, а также способность различных дезинфицирующих растворов для линз бороться с образованием бактериальных пленок [20].

Сетчатка, будучи одним из ключевых элементов глаза, обеспечивающих зрительную функцию, является важным объектом для экспериментов in vitro, в связи с чем вопрос культивирования ее клеток имеет достаточно высокое значение. Диссоциированные культуры клеток сетчатки активно используются в токсикологии и при скрининге лекарств. Органотипическое культивирование [21], а также получение органоидов и клеточных 3D-сфероидов сетчатки и ретинального пигментного эпителия (РПЭ) расширяют возможности скрининга лекарственных препаратов, позволяют моделировать широкий спектр заболеваний сетчатки, изучать процессы развития сетчатки и роль различных генов в этом процессе, разрабатывать новые подходы к лечению заболеваний заднего отрезка глаза методами регенеративной медицины [5, 22—24]. Тем не менее в патогенезе ряда заболеваний сетчатки существенную роль играют процессы, ассоциированные с иммунными клетками и сосудистым руслом. Особенно важную роль играют наружный и внутренний гематоретинальные барьеры [5], нарушение работы которых — неотъемлемая часть патогенеза таких заболеваний, как возрастная макулярная дегенерация, диабетический макулярный отек, диабетическая ретинопатия. Воспаление, гипоксия и гипергликемия активно вовлечены в нарушение работы гематоретинального барьера, равно как и индуцируемая ими продукция фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) [25].

Простейшая реализация наружного гематоретинального барьера в системе «орган-на-чипе» представляет собой микрофлюидную систему, в которой клетки РПЭ и сосудистого эндотелия высеяны на противоположных сторонах пористой мембраны. С каждой стороны соответствующие клетки на мембране омываются средой [26].

Устроенная по описанному выше принципу система, разработанная L.J. Chen и соавт. (2017), позволяет моделировать связанные с нарушением гематоретинальных барьеров патологии. Так, при имитации гипоксии путем перфузии через микрофлюидную систему раствора, содержащего CoCl₂, происходило увеличение секреции VEGF клетками РПЭ. Также перфузия среды с повышенным содержанием VEGF через камеру с клетками РПЭ приводила к процессам миграции в данную камеру эндотелиальных клеток через пористую мембрану по градиенту концентрации [27].

Системы «орган-на-чипе» с клетками РПЭ не только способны воспроизводить патологии как в вышеприведенном примере, но и позволяют применять различные терапевтические методики к данным моделям заболеваний [5]. Так, в работе M. Chung и соавт. (2018) в микрофлюидной системе, более детально моделирующей гематоретинальный барьер, путем введения VEGF моделировали влажную форму возрастной макулярной дегенерации. В микрофлюидном чипе происходила инфильтрация проникающими через фибриновый гидрогель эндотелиоцитами слоя клеток РПЭ. Последующее введение в систему использующегося для терапии данного заболевания препарата бевацизумаб предотвращало развитие патологической неоваскуляризации [5, 28].

Внутренний гематоретинальный барьер имеет общее происхождение с гематоэнцефалическим, являясь похожим на него в морфофункциональном отношении, и так же может быть смоделирован [29]. Для создания модели внутреннего гематоретинального барьера необходимо культивирование уже нейронных элементов сетчатки. Примером системы «орган-на-чипе», способной моделировать работу как наружного, так и внутреннего гематоретинального барьера, является устройство, описанное в работе J. Yeste и соавт. (2018). В разработанном данным коллективом микрофлюидном чипе на стеклянной пластине с массивом микроэлектродов располагалась конструкция из PDMS, образующая вместе с микроэлектродной подложкой семь продольных камер, лежащих в одной плоскости и отделенных друг от друга пористыми мембранами. Размер пор исключал миграцию клеток между камерами, однако допускал прорастание нейритов и межклеточные взаимодействия, в том числе с образованием контактов. Клетки высевались в следующей конфигурации: в трех центральных камерах располагались клетки нейробластомы человека линии SH-SY5Y, моделирующие нейроретину. В двух же крайних камерах, прилегающих к центральным, были расположены клетки эндотелия сосудов в одной и клетки РПЭ — в другой, что соответствовало внутреннему и наружному гематоретинальным барьерам. Электроды, расположенные под клетками сосудистого эндотелия и РПЭ, позволяли регистрировать в режиме реального времени изменения величины трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) [30], являющегося важнейшим электрофизиологическим параметром, позволяющим оценить барьерные и транспортные свойства эпителиального слоя. TEER характеризует транспорт ионов через эпителий, представляя собой интегральный показатель, включающий в себя как парацеллюлярную проводимость плотных межклеточных контактов, так и трансцеллюлярную проводимость клеточных мембран [31]. Путем оценки TEER данная система была валидирована авторами в качестве модели внутреннего и наружного гематоретинального барьера [5].

Системы «орган-на-чипе» также позволяют моделировать такое заболевание сетчатки, как глаукома, причем с учетом важной стороны его патогенеза — патологически повышенного внутриглазного давления [15]. В статье J. Wu и соавт. (2019) описана система, позволяющая устанавливать и поддерживать заданное гидростатическое давление в шести камерах из PDMS, содержащих первичные культуры ганглиозных клеток сетчатки. Уже на 3-и сутки культивирования ганглиозные клетки, находящиеся в камерах с разным давлением, демонстрируют серьезные различия в длине и структуре отростков: нахождение в камере с гидростатическим давлением выше 25 мм рт. ст. приводит к уменьшению длины аксонов и снижению ветвления дендритов. Таким образом, вышеописанная система является достаточно удобной платформой для изучения роли гидростатического давления в развитии дегенеративных процессов в сетчатке при глаукоме и потенциально может служить моделью для скрининга нейропротекторов для замедления гибели ганглиозных клеток при данном заболевании [15, 32].

Технология «орган-на-чипе», позволяющая с высокой степенью точности моделировать в заданных контролируемых условиях различные физиологические и патологические процессы, имеет большой потенциал в сфере экспериментальной офтальмологии и доклинических испытаний новых офтальмологических препаратов. Культивирование тканей глазного яблока и его вспомогательного аппарата в микрофлюидных системах позволяет выявлять токсическое воздействие и фармакологическую активность новых соединений и обеспечивает возможность более глубокого понимания нормальной физиологии органа зрения и патогенеза его заболеваний. При этом технология «орган-на-чипе» сокращает финансовые затраты и время, необходимые на проведение экспериментов, а также позволяет решить ряд этических проблем за счет уменьшения количества используемых в эксперименте животных, одновременно позволяя получить более точные модели, чем традиционные методы культивирования клеток и тканей.

Что касается видов моделируемых анатомических структур и их функций, технология «орган-на-чипе» представлена такими наиболее развитыми направлениями, как моделирование роговицы, и в более широком смысле, — передней поверхности глаза вместе с его вспомогательным аппаратом, вплоть до век. В рамках данного направления «роговица-на-чипе» и «моргающий глаз-на-чипе» используются чаще всего для моделирования синдрома сухого глаза и отработки технологий его лечения. Другое направление — моделирование сетчатки, в особенности гематоретинальных барьеров. Данная группа моделей широко используется для моделирования таких патологий сетчатки, как возрастная макулярная дегенерация, диабетический макулярный отек, диабетическая ретинопатия, глаукома, и испытаний методик, направленных на профилактику и терапию этих заболеваний.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.