Впервые термин «иммунная привилегия» был предложен P. Medawar в 1948 г. при описании способности некоторых тканей изменять иммунный ответ для максимального сохранения основных свойств [1]. Известно, что глаз относят к иммунологически привилегированным органам, характеризующимся наличием регуляторных механизмов, направленных на подавление индукции иммунного ответа (афферентная блокада), его изменение благодаря развитию иммунной толерантности, а также удаление эффекторных иммунных клеток за счет действия специфических молекул (эфферентная блокада) [2, 3].

Афферентная блокада определяется свойствами роговичной ткани (отсутствием кровеносных и лимфатических сосудов, низким содержанием антигенпрезентирующих дендритных клеток и макрофагов) и наличием гематоофтальмического барьера. Иммунная толерантность обусловлена низкой экспрессией антигенов главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex, MHC) I типа и отсутствием выработки белков MHC II типа клетками роговицы в покое [4].

Кроме того, по данным многочисленных исследований, существует «иммунное отклонение, связанное с передней камерой» (anterior chamber associated immune deviation, ACAID), при котором в ответ на появление антигенов происходит активация только CD8⁺ T-лимфоцитов [5, 6]. К регуляторным молекулам, экспрессируемым на мембранах эндотелиальных клеток (ЭК), относят CD86-лиганд, который, связываясь с рецепторами на поверхности T-лимфоцитов, препятствует их активации, CD95- и PD-лиганды (programmed death-ligand, PDL), индуцирующие апоптоз активированных T-лимфоцитов, их пролиферацию, а также выработку провоспалительных цитокинов [7, 8]. Еще одним компонентом эфферентной блокады иммунного ответа служат некоторые биологически активные эндогенные вещества (цитокины, хемокины и факторы роста), входящие в состав внутриглазной жидкости (ВГЖ) и обеспечивающие межклеточные взаимодействия [9].

Известно, что ВГЖ представляет собой прозрачную субстанцию, заполняющую переднюю и заднюю камеры глаза и формирующую внутриглазное давление (ВГД). Она образуется путем диффузии, ультрафильтрации и активной секреции плазмы крови и растворенных в ней веществ через стенки центральных артериол цилиарных отростков. Установлено, что ВГЖ отличают низкая концентрация белков и повышенное содержание хлорид-, лактат-, аскорбат-анионов в сравнении с плазмой крови [10, 11]. Вероятно, это связано с избирательной проницаемостью гематоофтальмического барьера, образуемого беспигментными эпителиальными клетками цилиарного тела. Кроме того, изменение состава ВГЖ часто является отражением развития патологического процесса в переднем отрезке глаза.

Все цитокины ВГЖ могут быть разделены на классы по доминирующему биологическому действию: провоспалительные (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α, IFNγ, MCP-1, MIP-1β), противовоспалительные (IL-4, IL-7, IL-8, IL-10), факторы, влияющие на рост и дифференцировку лимфоцитов (IL-2, IL-4, IL-5, IL-13, IL-17), и факторы роста (в том числе G-CSF, GM-CSF) [12, 13].

В последние годы было показано, что изменение концентрации эндогенных биологически активных веществ в ВГЖ тесно связано с уменьшением плотности ЭК роговицы, приводящим к эндотелиальной дисфункции с развитием длительного стромального отека и буллезных изменений эпителия (буллезная кератопатия — БК). Однако опубликованные исследования были выполнены с включением пациентов, относящихся только к азиатской популяции. В связи с этим полученные результаты не могут в полной мере отражать патологические процессы, лежащие в основе эндотелиальной дисфункции роговицы [14].

Как известно, нарушение эндотелиального барьера может быть обусловлено наследственной патологией — дистрофией Фукса (ДФ), когда ЭК приобретают фенотип фибробластов и начинают синтезировать каплевидные образования (гутты). К причинам развития БК относят механическое повреждение ЭК при проведении интраокулярных хирургических вмешательств, длительное отсутствие компенсации ВГД и инфекционные заболевания роговицы. Несмотря на различную этиологию БК, снижение барьерной функции эндотелиального слоя роговицы в большинстве случаев связано с нарушением целостности плотных и щелевидных межклеточных контактов, а также с развитием апоптоза ЭК [15, 16].

Цель исследования — изучение содержания эндогенных биологически активных веществ во внутриглазной жидкости у пациентов с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса и буллезной кератопатией.

Материал и методы

В исследование были включены 74 пациента (74 глаза). Первую группу составил 31 пациент с диагнозом эндотелиальная ДФ. Среди них 12 мужчин и 19 женщин. Средний возраст исследуемых был равен 72,7±9,2 года. Вторая группа была представлена 35 пациентами (23 мужчины, 12 женщин) с БК. Средний возраст составил 72,4±9,1 года (табл. 1). До операции всем больным измеряли толщину центральной зоны роговицы (RTvue-100 OCT, Optovue, США).

Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов

Пациентам 1-й и 2-й групп была выполнена задняя послойная кератопластика (автоматизированная эндотелиальная кератопластика с удалением десцеметовой мембраны, Descemet’s stripping automated endothelial keratoplasty (DSAEK), изолированная трансплантация десцеметовой мембраны с эндотелием, Descemet’s membrane endothelial keratoplasty (DMEK), или сквозная кератопластика (СКП).

В контрольную группу были включены 8 пациентов (8 глаз), сопоставимых по возрасту с больными основных групп, с диагнозом незрелая катаракта, которым была проведена факоэмульсификация с имплантацией интраокулярной линзы.

Критериями исключения пациентов из исследования были отсутствие компенсации ВГД, наличие острых воспалительных заболеваний глаз, гемофтальма, аутоиммунных и неопластических заболеваний любой локализации.

У всех пациентов на начальном этапе операции через парацентез инсулиновым шприцом с иглой 30G были взяты образцы ВГЖ (100—150 мкл), которые затем хранили при температуре –80 °C. Перед проведением иммунологического анализа образцы ВГЖ размораживали при температуре 18—20 °C и центрифугировали при температуре 4 °C со скоростью 10 000 об./мин в течение 10 мин.

Определение концентрации цитокинов (IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12(p70), IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, IFNγ, MCP-1, MIP-1β и TNF-α) в ВГЖ выполняли лазерным иммуноанализатором Bio-Plex 200 System (Bio-Rad, США) методом флуоресцентной проточной цитометрии с использованием стандартной 17-плексной тест-системы Bio-Plex Pro Human Cytokine Grp I Panel 17-plex (Bio-Rad, США).

Последующую обработку результатов осуществляли с помощью приложения Bio-Plex Manager 6,0 Properties (Bio-Rad, США). Статистический анализ данных проводили с использованием программы SPSS 23 (IBM). Согласно тесту Колмогорова—Смирнова, был выявлен ненормальный тип распределения переменных, в связи с чем в дальнейшем были использованы методы непараметрической статистики. Для оценки значимости различий между двумя независимыми выборками использовали U-критерий Манна—Уитни. Полученные данные представлены в виде среднего, минимального и максимального значений. Статистически значимыми различия считали при p<0,05.

Результаты и обсуждение

При анализе концентрации эндогенных биологически активных веществ в ВГЖ у пациентов 1-й и 2-й групп статистически значимых различий выявлено не было (табл. 2).

Таблица 2. Уровень цитокинов (пг/мл) во внутриглазной жидкости у пациентов с эндотелиальной дистрофией Фукса и буллезной кератопатией

Примечание. p* — сравнение пациентов с ЭД Фукса и контрольной группы. Критерий Манна—Уитни; p** — сравнение пациентов с БК и контрольной группы. Критерий Манна—Уитни; р*** — сравнение групп пациентов с ЭД Фукса и БК. Критерий Манна—Уитни. Полужирным шрифтом выделены статистически достоверные различия между группами (p<0,05).

Вероятно, это обусловлено тем, что в исследование были включены пациенты с ДФ на стадии декомпенсации (выраженный отек роговицы и буллезные изменения эпителия) и БК — состояниями, являющимися показанием для проведения хирургического лечения (DMEK, DSAEK или СКП). Так, средняя толщина роговицы в центральной зоне у больных 1-й группы составила 764,61±100,35 мкм, у пациентов 2-й группы — 777,14±136,35 мкм. Статистически значимых достоверных различий между группами не обнаружено (см. табл. 1).

При сравнении уровня IL-1β и TNF-α в ВГЖ у пациентов основных и контрольной групп не выявили статистически значимых различий (см. табл. 2), что свидетельствует об отсутствии локального острого воспалительного процесса.

Вместе с тем было отмечено достоверное отличие уровня IL-6, IL-8, GM-CSF, IFNγ, MCP-1, MIP-1β в ВГЖ у пациентов с ДФ и БК по сравнению с показателями пациентов контрольной группы (см. табл. 2).

IL-6 относят к мультифункциональным цитокинам, экспрессируемым иммунными (T-лимфоцитами, дендритными клетками, макрофагами) и неиммунными клетками (эпителиальными клетками, кератоцитами и ЭК). IL-6 обеспечивает сохранение T-клеток в очаге воспаления, индуцируя в них синтез белков-ингибиторов апоптоза (Bcl-2) [17]. IL-8 является α-хемокином, продуцируемым моноцитами/макрофагами, естественными киллерами (natural killers, NK), а также Th2-субпопуляцией CD4⁺-клеток. Он служит медиатором воспаления, обеспечивая миграцию гранулоцитов, моноцитов/макрофагов и лимфоцитов в патологический очаг [18]. Полученные нами данные согласуются с результатами, описанными в работе J. Rosenbaum и соавторов. Проведенное ими иммуногистохимическое исследование роговичных дисков, полученных при СКП у пациентов с БК, показало высокий уровень экспрессии IL-8 в эпителиальных клетках, кератоцитах и ЭК [19].

К провоспалительным цитокинам, индуцирующим пролиферацию и дифференцировку макрофагов стромы роговицы, также относят GM-CSF. Основным источником данного фактора служат Th1-лимфоциты, реже Th2- и CD8⁺-клетки [17]. Результаты мультиплексного анализа ВГЖ свидетельствуют о высокой концентрации GM-CSF в ВГЖ у пациентов с ДФ и БК, подтверждая наличие хронического локального воспалительного процесса (см. табл. 2). Сходные данные были получены T. Yamaguchi и соавторами, изучившими состав ВГЖ у пациентов с БК и низкой плотностью ЭК [20].

По данным мультиплексного анализа ВГЖ, у пациентов с ДФ и БК была обнаружена повышенная концентрация β-хемокинов MCP-1 и MIP-1β в сравнении с контролем (см. табл. 2). Подобные результаты были получены H. Yazu и соавторами при изучении состава ВГЖ у пациентов с БК [21]. Основным источником данных цитокинов являются макрофаги/моноциты стромы роговицы. В свою очередь, эти биологически активные эндогенные вещества служат хемоаттрактантами для моноцитов, Th1-клеток и NK [18]. M. Matthaei и соавторы показали, что у пациентов с ДФ в стадии декомпенсации в ВГЖ содержится MCP-1 в высокой концентрации. Данный фактор, являясь одним из медиаторов эпителиально-мезенхимального перехода, способствует приобретению ЭК фенотипических признаков фибробластов, а также рубцеванию экстрацеллюлярного матрикса стромы роговицы [22].

Также нами было выявлено достоверное повышение уровня IFN-γ в ВГЖ у пациентов 1-й и 2-й групп в сравнении с контрольной (см. табл. 2). Основной функцией данного цитокина является его участие в регуляции звеньев иммунного ответа. В связи с особенностями иммунной толерантности роговичной ткани основным источником IFN-γ служат CD8⁺-цитотоксические клетки (T-лимфоциты, CD8-лиганды которых связываются с молекулами MHC I типа ЭК) [17]. В исследовании I. Lahdou и соавторов, проведенном in vitro, было показано, что IFN-γ в высоких концентрациях индуцирует экспрессию молекул MHC II на мембранах ЭК роговицы. В результате происходит активация CD4⁺-клеток, которые затем дифференцируются в Th1- и Th2-лифоциты [23]. Вместе с тем отмечено, что IFN-γ способствует клеточному иммунитету, стимулируя продукцию субпопуляции Th1-клеток и угнетая выработку Th2-клеток [13].

Еще одним подтверждением Th1-предрасположенности иммунного ответа служит незначительное изменение уровня IL-4 и IL-13 (цитокинов, продуцируемых Th2-субпопуляцией) у пациентов с ДФ и БК по сравнению с группой контроля (см. табл. 2).

Известно, что ЭК роговицы обладают иммуномодулирующими свойствами. В исследованиях, проведенных in vitro, было показано, что ЭК, в свою очередь, препятствуют продукции IFN-γ CD4⁺ T-лимфоцитами. Кроме того, ЭК содержат на своих мембранах PDL1, которые, связываясь с PD молекулами Th-клеток, подавляют их превращение в Th1-лимфоциты [24]. Проведенные P. Sagoo и соавторами исследования показали, что длительная экспозиция (48 ч) культуры ЭК с раствором, содержащим такие провоспалительные цитокины, как IFN-γ, TNF-α, IL-lβ, способствует экспрессии индуцированной NO-синтазы (iNOS), катализирующей образование оксида азота (NO), обладающего цитотоксическим действием [25]. Результаты анализа образцов ВГЖ, полученных при проведении СКП, DMEK и DSAEK у пациентов с различной патологией роговицы, свидетельствуют о наличии прямой корреляции между высокой концентрацией IFN-γ и быстрым снижением плотности ЭК в послеоперационном периоде [20].

Заключение

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о повышении концентрации в ВГЖ при ДФ в фазе декомпенсации и БК таких цитокинов, как IL-6, IL-8, GM-CSF, IFN-γ, MCP-1, MIP-1β. Изменение данных показателей обусловливает развитие хронического локального воспаления, приводящего к ремоделированию роговичной ткани с исходом в фиброз. Проведенный мультиплексный анализ не выявил достоверных различий уровня эндогенных биологически активных веществ у пациентов с ДФ в фазе декомпенсации и БК. Полученные данные позволяют рассматривать эти состояния как патологический процесс, возникающий на фоне нарушения одного из механизмов, обеспечивающих «иммунную привилегию» глаза, ключевую роль в котором играют ЭК роговицы и эндогенные биологически активные вещества водянистой влаги передней камеры.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Н.Ф., С.Т.

Сбор и обработка материала: С.Т., К.А., В.В., А.С., Н.Ф.

Статистическая обработка: Н.Ф.

Написание текста: Н.Ф.

Редактирование: С.Т., В.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.