Мамиконян В.Р.

Учреждение Российской академии медицинских наук "НИИ глазных болезней РАМН", Москва

Осипян Г.А.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН, Москва

Догузов В.А.

ФГБУ «НИИ глазных болезней» РАМН, Россолимо ул., 11, А, Б, Москва, Российская Федерация, 119021

Розинова В.Н.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней», ул. Россолимо, 11 А, Б, Москва, Российская Федерация, 119021

Щукина Т.И.

ФГБНУ «НИИ глазных болезней», ул. Россолимо, 11, А, Б, Москва, 119021, Российская Федерация

Храйстин Х.

ФГБНУ «НИИ глазных болезней», ул. Россолимо, 11, А, Б, Москва, 119021, Российская Федерация

Объективизация оценки донорского материала для сквозной пересадки роговицы

Журнал: Вестник офтальмологии. 2017;133(6): 76-82

Просмотров : 11

Загрузок :

Как цитировать

Мамиконян В. Р., Осипян Г. А., Догузов В. А., Розинова В. Н., Щукина Т. И., Храйстин Х. Объективизация оценки донорского материала для сквозной пересадки роговицы. Вестник офтальмологии. 2017;133(6):76-82. https://doi.org/10.17116/oftalma2017133676-82

Авторы:

Мамиконян В.Р.

Учреждение Российской академии медицинских наук "НИИ глазных болезней РАМН", Москва

Все авторы (6)

По данным ВОЗ, слепота, возникшая вследствие поражения роговицы, занимает 4-е место (5,1%) среди основных причин существенного снижения зрения в мире после катаракты, глаукомы и возрастной макулярной дегенерации. При этом ежегодно в мире проводится более 200 000 операций по трансплантации роговицы [1].

Сквозная кератопластика (СКП) роговицы до сих пор является «золотым стандартом» и наиболее распространенным видом радикальной кератопластики. Вместе с тем в последние годы широкое применение получает задняя послойная (эндотелиальная) кератопластика (ЗПК) при отечных дистрофиях роговицы [2]. Качество и плотность клеток заднего эпителия или эндотелия кадаверной роговицы являются основными характеристиками, определяющими ее пригодность как для сквозной, так и для ЗПК [3].

Наиболее простым и общепринятым способом оценки состояния эндотелия роговицы является ее биомикроскопическая оценка по количеству складок и степени отечности стромы. Однако в современной офтальмологии для более достоверной оценки качества свежей донорской роговицы применяются методы зеркальной [4] и конфокальной [5] микроскопии ее заднего эпителия. При этом известно, что наибольшая сохранность клеток эндотелия возможна при изъятии аутопсийных глаз не более чем через 24 ч после смерти донора.

Сегодня сохранение заднего эпителия роговицы стало возможным благодаря разработке жидких питательных сред для ее среднепродолжительной консервации [6, 7]. Количество эндотелиоцитов донорской роговицы перед СКП, по современным требованиям, должно составлять не менее 2500 на 1 мм2 [2,8]. Важен тот факт, что оценить плотность эндотелиальных клеток (ПЭК) возможно и на консервированной роговице при помощи специального прибора — кератоанализатора. Однако необходимо признать, что в практической деятельности при оценке ПЭК кадаверной роговицы с помощью вышеперечисленных методов ее результаты существенно различаются между собой.

В связи с этим нами были поставлены задачи изучения различий в результатах, получаемых при разных методах исследовании ПЭК, и разработки объективных критериев и алгоритма оценки донорской роговицы для СКП и ЗПК.

Материал и методы

На 100 кадаверных глазах после стандартной биомикроскопической оценки роговицы проводили поочередный ее анализ, сначала на эндотелиальном, а затем на конфокальном микроскопах. Для достижения правильной фиксации кадаверного глаза использовали стандартный фиксатор и специальную подставку. Учитывая существенный разброс показателей ПЭК при разных методах исследования, проводилась ее оценка в 7 разных полях центральной зоны роговицы (рис. 1, а,

Рис. 1. Результаты ПЭК, полученные с помощью зеркальной (а) и конфокальной (б) микроскопии.
б). Затем выводили средние значения полученных данных по 3, 5 и 7 полям исследования на каждом приборе.

Далее в стерильных условиях при помощи стандартного набора инструментов выкраивали корнеосклеральный лоскут и помещали в консервирующую жидкую питательную среду.

Спустя 1 ч после консервации проводили анализ ПЭК с помощью кератоанализатора Konan ЕКА-04 (Япония) также в 7 полях (рис. 2, а,

Рис. 2. Оценка ПЭК с помощью кератоанализатора (а) и полученный результат (б).
б). Далее выводили среднее значение показателей кератоанализатора.

На 15 контрольных роговицах после поочередного исследования с помощью зеркального и конфокального микроскопов, а также кератоанализатора, проводили последующий подсчет клеток с помощью световой микроскопии. Последняя была выбрана в качестве контрольного метода, поскольку позволяет визуализировать непосредственно ядра эндотелиоцитов (при помощи люминесцентной окраски), что обеспечивает несравнимо большую точность подсчета ПЭК.

Таким образом, конечным этапом являлась оценка ПЭК уже консервированной роговицы с использованием светового микроскопа. При помощи трепана диаметром 8 или 9 мм выкраивали центральную зону корнеосклерального лоскута. Материал фиксировали в течение 10 мин при комнатной температуре параформальдегидом (4% раствор в фосфатно-солевом буфере). Затем отмывали от фиксатора фосфатно-солевым буфером и красили флуоресцентным красителем DAPI 10 мин при комнатной температуре. Отмывали от DAPI фосфатно-солевым буфером и проводили количественный анализ ядер эндотелиоцитов также в 7 полях с помощью флуоресцентного микроскопа Keyence BZ-9000 (рис. 3, 4,

Рис. 3. Оценка эндотелия с помощью цифрового флуоресцентного микроскопа (а, б).
Рис. 4. Результат ПЭК, полученный с помощью цифрового флуоресцентного микроскопа (а, б).
а, б). После этого, как и в предыдущих случаях, выводили средние значения полученных показателей.

Результаты и обсуждение

При подсчете ПЭК только в одном поле исследования с помощью зеркальной, конфокальной микроскопии и кератоанализатора наблюдается существенный разброс значений — от 1739 до 3274 кл/мм2. Результаты приведены в табл. 1, из

Таблица 1. Значения ПЭК кадаверной роговицы при исследовании одного поля
которой видно, что наибольшие показатели ПЭК в большинстве случаев определяются при зеркальной микроскопии, а наименьшие — при конфокальной.

Для анализа результатов исследования ПЭК в нескольких полях (3, 5, 7), кроме средних значений плотности, для каждого метода высчитывали размах выборки, т. е. разницу между максимальным и минимальным значением ПЭК для каждой донорской роговицы.

После этого высчитывали погрешность значений ПЭК, т. е. отличие результатов зеркальной, конфокальной микроскопии и кератоанализатора от данных контрольного метода.

Все результаты подсчетов представлены в табл. 2, 3,

Таблица 2. Сравнительный анализ значений ПЭК кадаверной роговицы при исследовании 3 полей
Таблица 3. Сравнительный анализ значений ПЭК кадаверной роговицы при исследовании 5 полей
4. Обращает на себя внимание тот факт, что для всех использованных приборов погрешность, или разница с контролем, не превышает 10% и является статистически недостоверной. Данное обстоятельство указывает на одинаковую точность средних значений ПЭК, получаемых при исследовании 3, 5 и 7 полей эндотелиальной поверхности.

В табл. 2—4

Таблица 4. Сравнительный анализ значений ПЭК кадаверной роговицы при исследовании 7 полей
обращают на себя внимание незначимые различия погрешностей каждого из методов между собой, что свидетельствует об их сопоставимости и равноценности для подсчета ПЭК кадаверной роговицы.

Таким образом, из полученных результатов следует, что для достоверной оценки донорской роговицы может быть использовано среднее значение 3-кратного измерения ПЭК с помощью любого из исследованных в работе методов.

Выводы

1. При исследовании эндотелия донорских роговиц с помощью зеркальной, конфокальной микроскопии и кератоанализатора разница в значениях однократного измерения ПЭК разными методами составила от 337 до 1243 (наибольшая разница для каждого глаза). Максимальные значения ПЭК определялись при зеркальной микроскопии, минимальные — при конфокальной.

2. При последовательном 3, 5 и 7-кратном измерении ПЭК разными методами погрешности их усредненных значений оказались статистически недостоверными как по сравнению со значениями контрольного измерения с помощью люминесцентного микроскопа, так и при сравнении примененных методов между собой.

3. Для достоверной оценки качества донорской роговицы может быть рекомендовано использование среднего значения не менее чем 3-кратного измерения ПЭК с помощью любого из иследованых методов — зеркальной или конфокальной микроскопии — на свежих донорских роговицах и аналогичного показателя, полученного с помощью кератоанализатора на консервированных лоскутах донорской роговицы.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: В.М., В.Д.

Сбор и обработка материала: Г. О., В.Д., В.Р.

Статистическая обработка: Т.Щ., Х.Х.

Написание текста: Г. О., В.Д.

Редактирование: В.М.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Догузов Владимир Анатольевич—аспирант

e-mail: vladimir.doguzov@gmail.com

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail