Ретинопатия недоношенных (РН) — тяжелое инвалидизирующее вазопролиферативное заболевание, патогенез которого носит сложный многофакторный характер. Многие аспекты развития РН, особенно ее тяжелых форм, остаются неясными до сих пор и с целью их изучения в настоящее время во всем мире активно проводятся экспериментальные исследования с применением различных животных моделей ретинальной неоваскуляризации [1].

Объектом моделирования являются новорожденные животные, васкуляризация сетчатки которых не закончена к моменту срочных родов, что позволяет сравнивать ее параметры с таковыми у недоношенного ребенка. Учитывая сложность индуцирования нарушений общесоматического статуса здоровых доношенных животных, фактором, запускающим развитие ретинопатии в эксперименте, служат изменения концентрации вдыхаемого ими кислорода. Выбор именно этого фактора обосновывается тем, что ангиогенез сетчатки носит кислородзависимый характер и колебания степени оксигенации крови недоношенных детей, являющиеся следствием эпизодов апноэ, бронхопульмональной дисплазии, других респираторных или метаболических осложнений, а также применения неадекватных схем кислородотерапии, являются одной из основ развития РН [2]. Определенное значение имеет также относительная техническая простота воздействия.

Наиболее популярными являются модели РН на грызунах, в частности на крысятах, в силу довольно высокого сходства процесса васкуляризации и строения сосудистой системы крысиных и человеческих глаз и как следствие сходства развивающейся у них экспериментальной РН (ЭРН) с РН у детей [3—5], а также целого ряда преимуществ работы с мелкими лабораторными животными [6]. Для проведения качественной экспериментальной работы следует отметить важность выбора адекватной крысиной модели РН, где ключевую роль в развитии ретинопатии играют именно колебания концентрации подаваемого в ходе эксперимента кислорода, не достигающей высоких значений [7], что позволяет сравнивать патогенетические основы развития ЭРН и РН в клинике, учитывая современные оптимизированные схемы кислородной поддержки при выхаживании недоношенных детей.

Актуальность проведения исследований с использованием экспериментальных моделей, помимо изучения вопросов этиопатогенеза РН, обусловлена возможностью поиска новых патогенетически ориентированных подходов к ее профилактике и лечению. Так, в настоящее время в качестве перспективного агента для профилактики и лечения заболеваний, индуцируемых окислительным стрессом, к числу которых в определенной мере относят и РН, активно рассматривается мелатонин [8]. Известно, что синтез мелатонина, помимо основного источника — эпифиза, осуществляется практически во всех тканях, в том числе тканях глаза, а именно в сетчатке и цилиарном теле [9], причем сетчатка занимает второе место после эпифиза по количеству синтезируемого мелатонина.

Мелатонин обладает широким спектром антиоксидантных, противовоспалительных, нейропротекторных, а также антиангиогенных свойств [10]. В сетчатке путем активации различных подтипов рецепторов он способен модулировать активность ретинальных нейронов. Кроме того, есть данные, свидетельствующие о способности мелатонина стабилизировать гематоретинальный барьер в условиях экспериментальной гипоксии [11].

Мы предположили, что мелатонин в силу разнообразия своих свойств способен воздействовать на различные звенья патогенеза РН.

Цельнашего исследования — оценка влияния экзогенного мелатонина на состояние гематоретинального барьера и антиоксидантный статус стекловидного тела крысят с ЭРН и анализ перспектив его применения для профилактики и лечения РН.

Исследование выполнено на 48 крысятах породы Вистар (96 глаз) в соответствии с ГОСТ 53434–2009 от 02.12.2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики GLP», постановлением главного государственного врача РФ № 51 от 29.08.2014 «Об утверждении СП 2.2.1.3218−14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)», Федеральным законом № 61-ФЗ от 12.04.2010 «Об обращении лекарственных средств». Протокол исследования был утвержден локальным этическим комитетом. Крысята были разделены на 4 группы по 12 особей: опытная группа (крысята с ЭРН), опытная группа на фоне введения мелатонина, контрольная группа и контрольная группа на фоне введения мелатонина. Следует отметить, что численность экспериментальных групп обусловлена стремлением к повышению достоверности результатов динамической оценки исследуемых параметров, проводимой с этой целью у крысят из одного помета (число крысят в помете 12—14).

С целью воспроизведения ЭРН новорожденных крысят на 14 сут помещали в инкубатор вместе с родившей их самкой. Каждые 12 ч концентрация кислорода в инкубаторе колебалась от 60 до 15%. Затем крысят помещали в условия с нормальным содержанием кислорода (21%). На протяжении эксперимента в помещении поддерживали постоянный температурный (+26 °С) и световой (12 ч день, 12 ч ночь) режимы.

Контрольную группу составили крысята, находившиеся с момента рождения в условиях с нормальным содержанием кислорода.

Еще двум группам крысят, находившихся в опытных и контрольных условиях, с 1-х по 14-е сутки интраперитонеально вводили раствор мелатонина (Sigma-Aldrich) в стерильном 0,05 М фосфатном буферном растворе (рН 7,4) объемом 30 мкл в дозе 10 мг/кг.

Крысят выводили из эксперимента на 7, 14-е и 18-е сутки (по 4 крысенка (8 глаз) из каждой группы на каждом сроке исследования). Всем крысятам в указанные сроки проводили бинокулярную энуклеацию, после чего глазное яблоко вскрывали по лимбу, удаляли роговицу и хрусталик, а с помощью полосок фильтровальной бумаги шириной 5 мм проводили забор образцов стекловидного тела. Фрагмент полоски, пропитанный жидкой частью стекловидного тела, взвешивали и помещали в 50-кратный объем 0,05 М фосфатного буферного раствора рН 7,4 для элюирования компонентов стекловидного тела на 20 мин. Затем образец центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 мин, и надосадочную жидкость использовали для исследования.

В каждом образце стекловидного тела определяли антиокислительную активность (АОА) [12] и концентрацию общего белка по Лоури [13].

Для измерения показателей антиокислительной активности была использована модельная система гемоглобин-Н₂О₂-люминол, в которой в качестве субстрата окисления выступает люминол [12]. Измерения проводили с использованием хемилюминометра Биотокс-7 (Россия, НПО «Энергия»). Измеряемым параметром являлась величина латентного периода, характеризующая АОА по отношению к гидроксильному радикалу (АОА-ОН^-). Для построения калибровочной кривой использовали тролокс, который представляет собой водорастворимый аналог витамина Е. АОА-ОН^- биологического материала по отношению к гидроксильному радикалу выражали в эквивалентной концентрации тролокса (в мкмоль/л).

Статистическую обработку результатов провели с использованием статистического пакета Microsoft Excel. Исследуемые выборки подвергнуты тесту на нормальность распределения. Показатели с нормальным распределением представлены как среднее значение (М) и стандартное отклонение (m), достоверность различий между показателями групп с уровнем значимости не менее 95% оценена с помощью параметрического t-критерия Стьюдента.

Полученные результаты представлены на рис. 1, 2.

Анализ результатов следует начать с оценки изучаемых показателей в контрольной и опытной группах крысят без введения мелатонина. Динамика изменений концентрации общего белка в стекловидном теле крысят контрольной группы отражала процессы созревания гематоретинального барьера и инволюции системы гиалоидных сосудов в постнатальном периоде. Сравнительный анализ уровня общего белка в стекловидном теле крысят двух групп показал, что данный показатель у опытных крысят существенно превышал таковой у крысят контрольной группы: на 7-е сутки — в 1,5 раза, на 14-е сутки — почти в 3 раза и на 18-е сутки — в 2 раза. Такое значительное увеличение содержания белка в стекловидном теле может происходить вследствие пролиферации сосудов с повышенной проницаемостью и выходом из них плазменных белков. Также это можно объяснить тем, что при ЭРН, помимо незрелости гематоретинального барьера, имеют место выраженные нарушения его структуры и функции на всех сроках наблюдения, что согласуется с данными литературы [14].

АОА в стекловидном теле крысят контрольной группы постепенно нарастала в динамике, что можно объяснить естественными процессами созревания и совершенствования системы защиты от свободнорадикального воздействия. У крысят с ЭРН АОА на 7-е сутки не отличалась от таковой в контроле, на 14-е сутки становилась выше контрольного уровня в 6,4 раза, а на 18-е сутки снижалась, однако по-прежнему превышала норму практически в 2 раза. Полученную динамику можно объяснить следующим. В течение 1-й недели, несмотря на повышенную по сравнению с контролем проницаемость гематоретинального барьера, АОА не увеличивалась, возможно, в силу «расходования» плазменных антиоксидантов на связывание свободных радикалов, содержание которых в этот период возрастает. Значительное повышение АОА в стекловидном теле на 2-й неделе может быть связано с поступлением в него плазменных антиоксидантов из патологически измененной ретинальной сосудистой сети вследствие нарушения гематоретинального барьера и процессов активной вазопролиферации, что подтверждается высоким значением содержания общего белка в стекловидном теле в этот период. Кроме того, определенный вклад может вносить возможное увеличение синтеза антиоксидантов in situ в самой сетчатке [15] в ответ на развивающийся окислительный стресс. Последующее снижение АОА у крысят опытной группы на 18-е сутки говорит скорее не об уменьшении интенсивности процессов перекисного окисления и начавшейся нормализации состояния стенок сосудов сетчатки, а о возросших затратах антиоксидантов в борьбе с активными формами кислорода, поскольку сохраняющаяся высокая концентрация белка в стекловидном теле свидетельствует о том, что проницаемость гематоретинального барьера по-прежнему остается нарушенной.

Ежедневное интраперитонеальное введение мелатонина в течение первых 14 сут после рождения привело к тому, что содержание общего белка и уровень АОА в стекловидном теле опытных крысят снизились практически до уровня данных показателей в контрольной группе на всех сроках наблюдения, что, по-видимому, объясняется способностью мелатонина стабилизировать гематоретинальный барьер и его выраженными антиоксидантными свойствами, а также косвенно подтверждает его антиангиогенную активность.

В контрольной группе крысят интраперитонеальное введение мелатонина в те же сроки оказало незначительное влияние на изучаемые показатели — отмечалась некоторая тенденция к снижению содержания белка и повышению антиокислительного потенциала стекловидного тела.

Воспроизведенная нами модель ЭРН по своей фазности обладает схожестью течения с РН в клинике: полученные в результате биохимических исследований данные свидетельствуют об этапности ретинальной неоваскуляризации. Применяемая при моделировании схема подачи кислорода, ведущая к дисбалансу ростовых факторов, позволяет рассчитывать на копирование патогенетических основ развития РН в эксперименте и делает модель адекватной для изучения различных аспектов ее патогенеза, а также для поиска новых перспективных медикаментозных подходов к ее профилактике и лечению.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что развитие ЭРН сопровождается резким повышением концентрации белка и АОА в стекловидном теле крысят, что свидетельствует о выраженных нарушениях проницаемости гематоретинального барьера и важной роли нарушений окислительного статуса как одного из звеньев этиопатогенеза Р.Н. Полученная динамика изменений АОА подтверждает обоснованность применения антиоксидантов именно на ранних этапах развития ретинопатии, т. е. до развития «пика» собственной антиокислительной активности, что согласуется с данными литературы [16].

Мелатонин при ежедневном интраперитонеальном введении в период начального нарушения постнатального развития сосудистой сети сетчатки при ЭРН способствует стабилизации гематоретинального барьера, а также проявляет выраженные антиоксидантные и антиангиогенные свойства.

В настоящее время большое число исследований посвящено протекторной роли мелатонина при различных заболеваниях неонатального периода. Получены весьма обнадеживающие результаты изучения эффективности применения мелатонина при таких заболеваниях новорожденных, как хроническая болезнь легких, перинатальное повреждение мозга, некротизирующий энтероколит [8]. Низкая токсичность мелатонина [17] и способность воздействовать сразу на несколько факторов патогенеза РН позволяют рассматривать мелатонин и его аналоги в качестве потенциального медикаментозного средства для профилактики и лечения РН в клинике, что, безусловно, требует дальнейшего всестороннего изучения безопасности и эффективности его применения.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Л.К., Н.Ч.

Сбор и обработка материала: О.Б., Н.О.

Статистическая обработка: О.Б.

Написание текста: Н.О.

Редактирование: Л.К., Н.Ч.

Конфликт интересов отсутствует