Увеличение частоты возникновения тяжелой патологии заднего отдела глаза, сопровождающейся патологическим ангиогенезом, обусловливает необходимость более глубокого изучения основных процессов развития ретинальных сосудов. Несмотря на большое количество научных работ, единого мнения о механизмах нормального и патологического ангиогенеза сетчатки до настоящего времени нет. Патологический ангиогенез является наиболее тяжелым проявлением ретинопатии при сосудистой патологии вне зависимости от ее этиологии: при сахарном диабете, возрастной макулярной дегенерации, у недоношенных детей и т.д. [10]. Неясность основных звеньев патогенеза этого состояния не позволяет разработать эффективные способы лечения, поэтому исследование сосудистой системы сетчатки по-прежнему актуально.

Цель настоящей работы — оптимизация иммунофлюоресцентного метода исследования сосудистой системы сетчатки в эксперименте, а также исследование удаленной в ходе трансцилиарной хирургии пролиферативной ткани в тотальных препаратах с использованием иммуногистохимических маркеров на пролиферативной активности эндотелиальных клеток.

В данном исследовании использовалось 79 глаз 7- или 15-дневных крысят приблизительно 1,5—2,5 мм в диаметре. После срединного разреза в области лимба удаляли роговицу, а затем и хрусталик, после чего сетчатку отслаивали от хориоидеи и склеры. Для лучшего распрямления сетчатки делали 4—5 надрезов по направлению к диску зрительного нерва (рис. 1).

Тотальные препараты сетчатки, фиксированные посредством транскардиальной перфузии 4% раствором параформальдегида, отмывали, обрабатывали антителами к следующим маркерам: фактору фон Виллебранда (vWF) («Chemicon», США), рибонуклеотидредуктазе (RR), («Umea», Швеция), Ki-67, ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA) («Novo Castra», США). vWF является маркером эндотелиальных клеток, а RR, Ki-67 и PCNA — маркерами пролиферации клеток. Затем сетчатки окрашивали вторичными антителами: антимышиными, конъюгированными с флюоресцентным красителем Су-2, и антикроличьими, конъюгированными с флюоресцентным красителем Texas Red («Jackson», США). При изучении сосудистой системы сетчатки использовали световой микроскоп Olympus CX41 с флюоресцентной насадкой и цифровой камерой (Olympus, Camedia), а также конфокальный микроскоп фирмы «Leica».

Препараты эпиретинальной ткани, удаленной у пациентов с диабетической ретинопатией в ходе хирургического лечения, помещали в раствор 4% параформальдегида, затем обрабатывали так же, как препараты сетчатки крыс. Дополнительно использовали маркеры глиальной ткани — антитела к глиальному кислому фибриллярному белку (GFAP), бисбензимид (Hoehst 33342) — флюоресцентный краситель, специфически связывающийся с ДНК клеток и окрашивающий их ядра. Исследовано 17 препаратов.

Изучение нарушений ангиоархитектоники, строения сосудистой стенки (капиллярные микроаневризмы, четкообразные изменения вен и т.д.), начальных этапов нормального и патологического ангиогенеза в полной мере невозможно на вертикальных срезах сетчатки. Особенности строения сетчатой оболочки, специфика расположения в ней сосудов дают возможность визуализации ее системы гемоциркуляции в тотальных препаратах. Данное преимущество по сравнению с другими высокодифференцированными тканями обусловлено плоской формой, относительной прозрачностью, небольшой толщиной и расположением сосудов преимущественно во внутренних слоях сетчатки. Однако полиморфизм и плотное расположение клеток, а, самое главное, большое количество нервных волокон не позволяют использовать распространенные методы окраски сосудов в тотальных препаратах. Так, широко известный метод импрегнации серебром, с успехом применяемый для других тканей, включая хориоидею [1, 2, 5], в нашем исследовании не показал достаточной информативности. Это связано с хорошим окрашиванием окисью серебра нервных волокон, которые на тотальных препаратах сетчатки не позволяли получить удовлетворяющую нас визуализацию сосудистой системы сетчатки. Много лет успешно применялась методика наливки сосудов различными смесями [9], в частности туши и желатина, с последующей обработкой сетчатки химотрипсином [4, 6, 8]. К недостаткам данного метода можно отнести неполное заполнение мелких сосудистых терминалей, концевых сосудистых петель, что создает особое неудобство при изучении ангиогенеза, а также невозможность использования иммуногистохимических маркеров.

Использованный в настоящем исследовании метод является модификацией предложенного в 1983 г. способа изучения сетчатки глаза [10] и демонстрирует высокое качество визуализации сосудистой системы сетчатки на тотальных ее препаратах (рис. 2—4).

Методика исследования эпиретинальных мембран, удаленных en block, является оригинальной и имеет большие возможности в изучении особенностей процесса неоангиогенеза в заднем отделе глаза при сахарном диабете. Она позволяет изучать особенности ангиоархитектоники в новообразованной ткани, дифференцировать артериальные и венозные сосуды, что в совокупности с предоперационной флюоресцеиновой ангиографией позволяет отмечать варианты взаимодействия патологических новообразованных сосудов, происходящих из различных систем гемоциркуляции: хориоидальной или ретинальной [3]. Использование специфических антител к глиальной ткани (рис. 5, 6),

К недостаткам описанного метода следует отнести относительно высокую себестоимость и недолговечность препаратов, а следовательно, невозможность создания архива, хотя препараты могут долго сохраняться в морозильной камере. Впрочем, последний недостаток компенсируется возможностью получения и компьютерной обработки трехмерных изображений, в том числе полученных с помощью конфокальной микроскопии.

Предложенный метод имеет значительные преимущества при исследовании сосудистой системы сетчатки и эпиретинальной пролиферативной ткани:

— возможность высококачественной визуализации сосудистой системы в тотальных препаратах, что позволяет объективно оценивать и изучать макро- и микрососудистые нарушения (микроаневризмы, венозные петли, четкообразные их изменения и т.д.), а также нарушения и изменения ангиоархитектоники;

— возможность качественной визуализации концевых сосудистых петель и мелких сосудистых терминалей, что неоценимо при изучении нормального и патологического ангиогенеза;

— возможность использования специфических иммуногистохимических маркеров ко всем типам клеток (глии, эндотелию, нейронам), определения их пролиферативной активности открывает большие перспективы изучения этой методики.