Сдобникова С.В.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН, Москва

Ревищин А.В.

Институт биологии гена РАН, Москва

Павлова Г.В.

ФГБУ "Институт биологии гена" РАН

Гаврилова Б.А.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН

Сдобникова Л.Е.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН

Сурнина З.В.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН

Возможности иммунофлюо­ресцентного метода при исследовании сосудистой системы сетчатки и эпиретинальной пролиферативной ткани (экспериментальное исследование)

Журнал: Вестник офтальмологии. 2013;129(4): 10-13

Просмотров : 30

Загрузок : 1

Как цитировать

Сдобникова С. В., Ревищин А. В., Павлова Г. В., Гаврилова Б. А., Сдобникова Л. Е., Сурнина З. В. Возможности иммунофлюо­ресцентного метода при исследовании сосудистой системы сетчатки и эпиретинальной пролиферативной ткани (экспериментальное исследование). Вестник офтальмологии. 2013;129(4):10-13.

Авторы:

Сдобникова С.В.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН, Москва

Все авторы (6)

Увеличение частоты возникновения тяжелой патологии заднего отдела глаза, сопровождающейся патологическим ангиогенезом, обусловливает необходимость более глубокого изучения основных процессов развития ретинальных сосудов. Несмотря на большое количество научных работ, единого мнения о механизмах нормального и патологического ангиогенеза сетчатки до настоящего времени нет. Патологический ангиогенез является наиболее тяжелым проявлением ретинопатии при сосудистой патологии вне зависимости от ее этиологии: при сахарном диабете, возрастной макулярной дегенерации, у недоношенных детей и т.д. [10]. Неясность основных звеньев патогенеза этого состояния не позволяет разработать эффективные способы лечения, поэтому исследование сосудистой системы сетчатки по-прежнему актуально.

Цель настоящей работы — оптимизация иммунофлюоресцентного метода исследования сосудистой системы сетчатки в эксперименте, а также исследование удаленной в ходе трансцилиарной хирургии пролиферативной ткани в тотальных препаратах с использованием иммуногистохимических маркеров на пролиферативной активности эндотелиальных клеток.

Материал и методы

В данном исследовании использовалось 79 глаз 7- или 15-дневных крысят приблизительно 1,5—2,5 мм в диаметре. После срединного разреза в области лимба удаляли роговицу, а затем и хрусталик, после чего сетчатку отслаивали от хориоидеи и склеры. Для лучшего распрямления сетчатки делали 4—5 надрезов по направлению к диску зрительного нерва (рис. 1).

Рисунок 1. Нативный препарат. Сетчатка 7-дневного крысенка. Ув. 8.

Тотальные препараты сетчатки, фиксированные посредством транскардиальной перфузии 4% раствором параформальдегида, отмывали, обрабатывали антителами к следующим маркерам: фактору фон Виллебранда (vWF) («Chemicon», США), рибонуклеотидредуктазе (RR), («Umea», Швеция), Ki-67, ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA) («Novo Castra», США). vWF является маркером эндотелиальных клеток, а RR, Ki-67 и PCNA — маркерами пролиферации клеток. Затем сетчатки окрашивали вторичными антителами: антимышиными, конъюгированными с флюоресцентным красителем Су-2, и антикроличьими, конъюгированными с флюоресцентным красителем Texas Red («Jackson», США). При изучении сосудистой системы сетчатки использовали световой микроскоп Olympus CX41 с флюоресцентной насадкой и цифровой камерой (Olympus, Camedia), а также конфокальный микроскоп фирмы «Leica».

Препараты эпиретинальной ткани, удаленной у пациентов с диабетической ретинопатией в ходе хирургического лечения, помещали в раствор 4% параформальдегида, затем обрабатывали так же, как препараты сетчатки крыс. Дополнительно использовали маркеры глиальной ткани — антитела к глиальному кислому фибриллярному белку (GFAP), бисбензимид (Hoehst 33342) — флюоресцентный краситель, специфически связывающийся с ДНК клеток и окрашивающий их ядра. Исследовано 17 препаратов.

Результаты и обсуждение

Изучение нарушений ангиоархитектоники, строения сосудистой стенки (капиллярные микроаневризмы, четкообразные изменения вен и т.д.), начальных этапов нормального и патологического ангиогенеза в полной мере невозможно на вертикальных срезах сетчатки. Особенности строения сетчатой оболочки, специфика расположения в ней сосудов дают возможность визуализации ее системы гемоциркуляции в тотальных препаратах. Данное преимущество по сравнению с другими высокодифференцированными тканями обусловлено плоской формой, относительной прозрачностью, небольшой толщиной и расположением сосудов преимущественно во внутренних слоях сетчатки. Однако полиморфизм и плотное расположение клеток, а, самое главное, большое количество нервных волокон не позволяют использовать распространенные методы окраски сосудов в тотальных препаратах. Так, широко известный метод импрегнации серебром, с успехом применяемый для других тканей, включая хориоидею [1, 2, 5], в нашем исследовании не показал достаточной информативности. Это связано с хорошим окрашиванием окисью серебра нервных волокон, которые на тотальных препаратах сетчатки не позволяли получить удовлетворяющую нас визуализацию сосудистой системы сетчатки. Много лет успешно применялась методика наливки сосудов различными смесями [9], в частности туши и желатина, с последующей обработкой сетчатки химотрипсином [4, 6, 8]. К недостаткам данного метода можно отнести неполное заполнение мелких сосудистых терминалей, концевых сосудистых петель, что создает особое неудобство при изучении ангиогенеза, а также невозможность использования иммуногистохимических маркеров.

Использованный в настоящем исследовании метод является модификацией предложенного в 1983 г. способа изучения сетчатки глаза [10] и демонстрирует высокое качество визуализации сосудистой системы сетчатки на тотальных ее препаратах (рис. 2—4).

Рисунок 2. Конфокальная микроскопия тотального препарата сетчатки 7-дневного крысенка, окрашенного антителами к RR (а) и к vWF (б). а — капиллярная сеть с пролиферирующими эндотелиальными клетками (флюоресцируют зеленым светом); б — все эндотелиальные клетки содержат vWF и флюоресцируют красным светом. Слева виден магистральный венозный сосуд, содержащий vWF (б), но не окрашенный на RR (а). Ув. 200.
Рисунок 3. Обзорная микрофотография тотального препарата сетчатки 7-дневного крысенка, окрашенного антителами к RR. Ув. 40.
Рисунок 4. Концевые петли новообразованных капилляров (а) и их ядер (б) в пролиферативной мембране при диабетической ретинопатии, окрашенные антителами к vWF. Ув. 400.
Использование окраски указанными выше антителами хорошо выявляет терминальные сосудистые петли при незавершенном нормальном ангиогенезе (см. рис. 4). Параллельное использование на тех же препаратах маркеров пролиферативной активности клеток (Ki-67, PCNA, RR) и маркера эндотелия (vWF) позволило количественно оценивать и сравнивать выраженность нормального ангиогенеза у новорожденных животных, а также выявлять наиболее активные «зоны роста» сосудов (см. рис. 2, 4). Использование тотальных препаратов сетчатки дает возможность наблюдать и прослеживать на значительном протяжении специфику различных стадий развития изучаемого процесса.

Методика исследования эпиретинальных мембран, удаленных en block, является оригинальной и имеет большие возможности в изучении особенностей процесса неоангиогенеза в заднем отделе глаза при сахарном диабете. Она позволяет изучать особенности ангиоархитектоники в новообразованной ткани, дифференцировать артериальные и венозные сосуды, что в совокупности с предоперационной флюоресцеиновой ангиографией позволяет отмечать варианты взаимодействия патологических новообразованных сосудов, происходящих из различных систем гемоциркуляции: хориоидальной или ретинальной [3]. Использование специфических антител к глиальной ткани (рис. 5, 6),

Рисунок 5. Фрагмент пролиферативной ткани при диабетической ретинопатии, удаленный в ходе трансцилиарной хирургии, окрашенный антителами к ядрам клеток (Hoehst). Хорошо видны артерии, имеющие поперечную исчерченность, и вены. Ув. 200.
Рисунок 6. Глиальные клетки (а) с ядрами (б), окрашенные антителами к глиальному кислому фибриллярному белку (GFAP), бисбензимидом (Hoehst 33342) — флюоресцентным красителем, специфически связывающимся с ДНК клеток и окрашивающим их ядра. Ув. 400.
маркеров пролиферативной активности и т.д. позволяет более детально изучать стадии развития пролиферативного процесса.

К недостаткам описанного метода следует отнести относительно высокую себестоимость и недолговечность препаратов, а следовательно, невозможность создания архива, хотя препараты могут долго сохраняться в морозильной камере. Впрочем, последний недостаток компенсируется возможностью получения и компьютерной обработки трехмерных изображений, в том числе полученных с помощью конфокальной микроскопии.

Заключение

Предложенный метод имеет значительные преимущества при исследовании сосудистой системы сетчатки и эпиретинальной пролиферативной ткани:

— возможность высококачественной визуализации сосудистой системы в тотальных препаратах, что позволяет объективно оценивать и изучать макро- и микрососудистые нарушения (микроаневризмы, венозные петли, четкообразные их изменения и т.д.), а также нарушения и изменения ангиоархитектоники;

— возможность качественной визуализации концевых сосудистых петель и мелких сосудистых терминалей, что неоценимо при изучении нормального и патологического ангиогенеза;

— возможность использования специфических иммуногистохимических маркеров ко всем типам клеток (глии, эндотелию, нейронам), определения их пролиферативной активности открывает большие перспективы изучения этой методики.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail